COMPUESTOS TENSIOACTIVOS "GEMINI" CON ENLACE ÉSTER PARA USO EN TERAPIA GÉNICA.

Un compuesto que tiene la estructura general de fórmula (I): en la que Y,

que pueden ser iguales o diferentes en cada caso, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, ornitina, ácido diaminobutírico o ácido diaminopropionico, cuyo aminoácido está unido al N en la fórmula (I) mediante un enlace peptídico (amida) entre el N y el grupo carboxi en el resto de aminoácido; R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, son una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada, saturada o insaturada, de 10 a 24 átomos de carbono; n es de 1 a 10; y p es de 1 a 6; seleccionan de: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo

Esta invención se refiere a compuestos tensioactivos unidos a éster recién identificados, al uso de dichos compuestos y a su producción. La invención también se refiere al uso de los compuestos tensioactivos unidos a éster para facilitar la transferencia de compuestos a células para el suministro de fármacos. Los compuestos con propiedades relacionadas con las propiedades de los compuestos de la 5 invención se denominan a menudo tensioactivos Gemini.

Los tensioactivos son sustancias que afectan de forma notable a las propiedades superficiales de un líquido, incluso en bajas concentraciones. Por ejemplo, los tensioactivos reducirán de forma significativa la tensión superficial cuando se disuelven en agua o disoluciones acuosas y reducirán la tensión interfacial entre dos líquidos o entre un líquido y un sólido. Esta propiedad de las moléculas 10 tensioactivas se ha aprovechado en la industria, en particular en las industrias de detergentes y del petróleo. En los años 70 se describió una nueva clase de moléculas tensioactivas, caracterizadas por dos cadenas hidrófobas con cabezas polares que están unidas por un puente hidrófobo (Deinega,Y. et al., Kolloidn. Zh. 36, 649, 1974). Estas moléculas, que se han denominado "gemini" (Menger, F.M. y Littau, C.A., J. Am. Chem. Soc. 113, 1451, 1991), tienen muchas propiedades deseables con respecto a sus 15 equivalentes monómeras. Por ejemplo, son muy eficaces en la reducción de la tensión interfacial entre aceite y líquidos basados en agua, y tienen una concentración micelar crítica muy baja (Menger, F.M. y Keiper, J.S., Angewandte. Chem. Int. Ed. Engl., 2000, 39, 1906).

Los tensioactivos catiónicos se han usado, entre otros, para la transfección de polinucleótidos en células en cultivo, y existen ejemplos de dichos agentes disponibles en el comercio para los científicos 20 relacionados con las tecnologías genéticas (por ejemplo, el reactivo TfxTM-50 para la transfección de células eucariotas disponible en Promega Corp. WI, EE.UU.).

El suministro eficaz de ADN al interior de células in vivo, bien para terapia génica o para terapia antisentido, ha sido un objetivo prioritario durante muchos años. Se ha puesto mucha atención en el uso de virus como vehículos de suministro, por ejemplo adenovirus para células epiteliales en el tracto 25 respiratorio con fines de terapia génica correctiva para la fibrosis quística (CF). Sin embargo, a pesar de algunas pruebas de transferencia génica satisfactoria en pacientes con CF, la vía de adenovirus sigue siendo problemática debido a efectos secundarios inflamatorios y una expresión transitoria limitada del gen transferido. Se han investigado varios métodos alternativos para el suministro de genes in vivo, incluyendo estudios que usan tensioactivos catiónicos. Gao, X. et al. Gene Ther. 2, 710-722, 1995, 30 demostraron la idoneidad de esta técnica con un gen humano normal para el regulador de conductancia transmembrana en la CF (CFTR) en el epitelio respiratorio de ratones con CF usando lípidos catiónicos portadores de amina. Este grupo realizó un seguimiento con un ensayo de terapia génica para CF liposomal que, aunque solo con un éxito parcial, demostró la posibilidad de esta técnica en seres humanos (Caplen, N.J. et al., Nature Medicine, 1, 39-46, 1995). Más recientemente, otros grupos han 35 investigado el potencial de otros lípidos catiónicos para el suministro de genes (Miller, A, Angew. Int. Ed. Engl., 37, 1768-1785, 1998), por ejemplo derivados de colesterol (Oudrhiri, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 1651-1656, 1997). Este estudio limitado demostró la capacidad de estos compuestos basados en colesterol para facilitar la transferencia de genes en células epiteliales tanto in vitro como in vivo, apoyando de este modo la validez de esta técnica general. 40

Recientemente, se ha revisado el uso de vectores no víricos (lípidos catiónicos) para la transfección de genes, véase D. Niculescu-Duvaz, J. Heyes y C. J. Springer, Curr. Med. Chem., 2003, 10, 1233.

Estos estudios, y otros, muestran que en este nuevo campo de investigación existe una continua

necesidad de desarrollar nuevas moléculas tensioactivas de baja toxicidad para facilitar la transferencia eficaz de polinucleótidos al interior de células tanto in vitro para la transfección en experimentación basada en células como in vivo para terapia génica y tratamientos antisentido. Se han hecho previamente los tensioactivos Gemini basados en cisteína (documento WO99/29712) o en espermina (documento WO00/77032) o diamina (documento WO00/76954). Se encuentran otros ejemplos de tensioactivos 5 gemini en los documentos WO00/27795, WO02/30957, WO02/50100, WO03/82809, GB0425555.0 y GB0425556.8. El uso de tensioactivos Gemini como vectores polinucleótidos se ha revisado recientemente (A.J. Kirby, P. Camilleri, J.B.F.N. Engberts, M.C. Feiters, R.J.M. Nolte, O. Söderman, M. Bergsma, P.C. Bell, M. L. Fielden, C. L. García Rodriguez, Philippe Guédat, A. Kremer, C. McGregor, C. Perrin, G. Ronsin y M. C. P. van Eijk, Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 1448, véase también R. Zana y J. 10 Xia, Gemini Surfactants, Marcel Dekker, NY, 2004).

Una técnica recientemente desarrollada implica el uso de moléculas sintéticas de ARN bicatenario interferente pequeño (si) para suprimir transitoriamente la función génica. Esta técnica de ARN interferente (ARNi), inventada originalmente a partir del trabajo en C.elegans (A. Fire, Trends Genet., 1999, 15(9), 358), más tarde se desarrolló de modo que se pudiera aplicar su uso a células de 15 mamífero (S. M. Elbashir, J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin, K. Weber, T. Tuschl, Nature, 2001, 411, 494). La capacidad para suministrar estas moléculas efectoras de ARNsi en el sitio correcto de la mayoría de una población celular es una etapa clave en el uso eficaz de esta tecnología. Una vez localizada correctamente la cadena antisentido del dúplex de ARN, se une a la región complementaria del ARN(m) mensajero al que va dirigido (que codifica la diana de interés), conduciendo a la hidrólisis del 20 ARNm y su posterior degradación. Esta reducción transitoria del ARNm conduce a una reducción transitoria de la expresión del gen diana. Se requiere un suministro muy eficaz y la localización correcta para reducir la expresión del gen diana a niveles en los que se pueda elucidar la función de la diana.

Se conoce el uso de derivados de N,N-bis-dimetil-1,2-etanodiamina como vectores para el suministro de genes (E. Fisicaro et. al. Biochimica et Biophysica Acta, 1722 (2005), 224 - 233) 25

La presente invención busca mejorar las propiedades de los compuestos existentes.

La invención se refiere a compuestos que tienen la estructura general de fórmula (I):

en la que Y, que pueden ser iguales o diferentes en cada caso, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, ornitina, ácido diaminobutírico o ácido diaminopropionico, cuyo 30 aminoácido está unido al N en la fórmula (I) mediante un enlace peptídico (amida) entre el N y el grupo carboxi en el resto de aminoácido;

R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, son una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada, saturada o insaturada, de 10 a 24 átomos de carbono;

n es de 1 a 10; y 35

p es de 1 a 6;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una realización preferida, la cadena de hidrocarburo lineal o ramificada, saturada o insaturada, R1 o R2 tiene 12 o más átomos de carbono, por ejemplo 14 o más, por ejemplo 16 o más átomos de carbono. En una realización preferida adicional, la cadena de hidrocarburo lineal o ramificada, 40

saturada o insaturada, R1 o R2 de 10 a 24 átomos de carbono, se selecciona de:

–(CH2)10CH3

–(CH2)12CH3

–(CH2)14CH3

–(CH2)16CH3 5

–(CH2)18CH3

–(CH2)20CH3

- (CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 mezcla natural

- (CH2)7CH=CH(CH2)5CH3 mezcla natural

- (CH2)7CH=CH(CH2)5CH3 Cis 10

- (CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 Cis

–(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3 Trans

–(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 Trans

- (CH2)7CH=HCH2CH=CH(CH2)4CH3

–(CH2)7(CH=CHCH2)3CH3 15

–(CH2)3CH=CH(CH2CH=CH)3(CH2)4CH3

- (CH2)7CHCH(CH2)7CH3

- CH2CH(CH3)[CH2CH2CH2CH(CH3)]3CH3

o... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto que tiene la estructura general de fórmula (I):

en la que Y, que pueden ser iguales o diferentes en cada caso, es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, ornitina, ácido diaminobutírico o ácido diaminopropionico, cuyo aminoácido está unido al N en la fórmula (I) mediante un enlace peptídico (amida) entre el N y el grupo 5 carboxi en el resto de aminoácido;

R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, son una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada, saturada o insaturada, de 10 a 24 átomos de carbono;

n es de 1 a 10; y

p es de 1 a 6; 10

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que n es 4.

3. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que p es 2.

4. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R1 y R2 se seleccionan de: 15

–(CH2)10CH3

–(CH2)12CH3

–(CH2)14CH3

–(CH2)16CH3

–(CH2)18CH3 20

–(CH2)20CH3

- (CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 mezcla natural

- (CH2)7CH=H(CH2)5CH3 mezcla natural

- (CH2)7CH=CH(CH2)5CH3 Cis

- (CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 Cis 25

–(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3 Trans

–(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 Trans

–(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3

- (CH2)7(CH=CHCH2)3CH3.

–(CH2)3CH=CH(CH2CH=CH)3(CH2)4CH3 30

- (CH2)7CHCH(CH2)7CH3

- CH2CH(CH3)[CH2CH2CH2CH(CH3)]3CH3

o -(CH2)22CH3.

5. Un compuesto según la reivindicación 4, en el que R1 y R2 se seleccionan de:

(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 mezcla natural, 35

(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 Cis y

(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 Trans.

6. El compuesto de fórmula:

7. El compuesto de fórmula:

8. El compuesto de fórmula:

5

9. El compuesto de fórmula:

10. El uso de un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para facilitar la transfección de ADN o ARN o análogos de los mismos en una célula eucariota o procariota in vitro. 10

11. El uso de un compuesto según la reivindicación 10, en el que el compuesto se usa en combinación con uno o más complementos seleccionados del grupo consistente en:

(i) un vehículo neutro; o

(ii) un reactivo complejante.

12. El uso según la reivindicación 11, en el que el vehículo neutro es dioleil-fosfatidiletanolamina 15 (DOPE).

13. El uso según la reivindicación 11 ó 12, en el que el reactivo complejante es el reactivo PLUS.

14. El uso según la reivindicación 11 ó 12, en el que el reactivo complejante es un péptido que comprende fundamentalmente aminoácidos básicos.

15. El uso según la reivindicación 14, en el que el péptido consiste en aminoácidos básicos.

16. El uso según la reivindicación 15, en el que los aminoácidos básicos se seleccionan de lisina y arginina.

17. El uso según la reivindicación 15, en el que el péptido es polilisina o poliornitina.