COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN CONJUGADOS DE PEG-INTERFERÓN ALFA Y RAFINOSA COMO CRIOPROTECTOR.

Composiciones que comprenden conjugados de PEG-interferón alfa y rafinosa como crioprotector Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevas formulaciones liofilizadas y estabilizadas de conjugados de PEG-interferón alfa y a procesos para su preparación. Antecedentes de la invención ES 2 365 832 T3 La principal desventaja del uso terapéutico de la mayoría de los productos biológicos es que se administran a través de una ruta parenteral, por ejemplo, de manera intra-venosa (i.v.), sub-cutánea (s.c.) o intra-muscular (i.m.), etc., lo que significa que la administración al paciente está asociada con dolor y molestia. Además, debido a que normalmente presentan semividas cortas, los materiales biológicos requieren administraciones frecuentes al paciente con el fin de mantener los niveles terapéuticos del fármaco en sangre. Muchos tipos de inyecciones que no se pueden auto-administrar requieren visitas frecuentes a la clínica, lo que supone una molestia adicional para el paciente. Existen muchos ejemplos de dichos fármacos biológicos que requieren una administración frecuente. Interferón alfa -2a (Roferon, Roche) e interferón alfa-2b (Intron A, Schering AG), las dos formas recombinantes de interferón alfa humana, usadas en el tratamiento de hepatitis B y C crónicas presentan una semivida menor que 12h (McHutchison et al., Engl. J. Med. 1998, 339, 1485-1492; Glue, et al., Clin. Pharmacol. Ther. 2000, 68, 556-557) y por tanto requieren una administración del fármaco de al menos 3 veces por semana. También se requieren inyecciones repetidas con interferón beta-1b (Betaseron) para el tratamiento de pacientes que padecen esclerosis múltiple (MS). La dosificación recomendada se administra diariamente por vía sub-cutánea. Otro ejemplo de fármaco que precisa de inyecciones repetidas es filgrastim (factor estimulador de las colonias de granulocitos, o G-CSF), en el que la inyección es administrada diariamente para una duración del tratamiento de dos semanas. Otro método satisfactorio y muy aceptado para solucionar el inconveniente de las inyecciones frecuentes de dosificación elevada para mantener los niveles de umbral del fármaco en el cuerpo es aumentar la semivida in-vivo de la proteína terapéutica mediante conjugación con un polímero, preferentemente polietilenglicol (PEG). Se piensa que las moléculas de PEG, con sus largas cadenas, crean un escudo protector alrededor de la molécula de fármaco pegilada en disolución acuosa, y por tanto, contribuyen a reducir la inmunogenia de los fármacos de proteína al tiempo que también los protegen de la acción de las proteasas. Además de esto, debido a su gran volumen hidrodinámico, las moléculas de PEG son capaces de reducir la tasa de depuración renal del fármaco al tiempo que alargan la semivida del fármaco de proteína en la circulación. La conjugación de proteínas a PEG se ha documentado desde los años 70. Normalmente, los restos de PEG se unen a la proteína en primer lugar activando el resto PEG y posteriormente haciéndolo reaccionar con las cadenas laterales de los residuos de lisina y/o con el grupo amino N-terminal de la proteína. El PEG más frecuentemente usado es PEG monofuncional ya que este resto resiste la reticulación y la agregación. Un ejemplo ha sido descrito por Davis et al. en la patente de EE.UU. Nº. 4.179.337. Se formaron conjugados de PEG-proteína haciendo reaccionar un material biológicamente activo con una concentración de exceso molar de polímero altamente activado que tiene un grupo de enlace terminal con respecto al cual el polímero se uniría a la proteína y que da lugar a una composición de polipéptido soluble en agua, no inmunogénico y fisiológicamente activo. La pegilación de interferones se ha documentado en las patentes de EE.UU. Nos. 4.766.106 y 4.917.888 que describen, entre otros, un interferón beta conjugado con polímeros activados que incluyen mPEG-2,4,6-tricloro-S-triazina, glutarato de mPEG-N-succinimidilo o succinato de mPEG-N-succinimidilo. Una de tales descripciones de la patente de EE.UU. Nº. 5.951.974 describe la conjugación de un interferón a un polímero considerablemente no antigénico en el sitio de la histidina. Otra de dichas descripciones, en la patente de EE.UU: Nº. 5.981.709 describe un conjugado de interferón alfa-polímero con una semivida in-vivo de circulación relativamente larga. Algunas proteínas terapéuticas pegiladas disponibles comercialmente incluyen, ADAGEN (adenosin desaminasa bovina pegilada), que se usa para tratar síndrome de inmunodeficiencia combinada agudo con unión X; PEGASYS (alfa-interferón 2a pegilado), que se usa en el tratamiento de la hepatitis C; PEG-Intron (alfa-interferón 2b pegilado) para hepatitis C crónica; Oncaspar (L-asparaginasa pegilada) para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda en pacientes que presentan hipersensibilidad a la forma no modificada nativa de L-asparaginasa; y Neulasta (factor estimulador de la colonia de granulocito humano de metionilo recombinante pegilado) para quimioterapia de cáncer inducida por neutrocitopenia. El virus de la hepatitis C (HCV) es una de las principales causas de enfermedad hepática en el mundo. Alrededor de 200 millones de personas se encuentran afectadas a lo largo del mundo. Se ha comprobado que el interferón en combinación con Ribavirin resulta eficaz para reducir la carga viral en pacientes con hepatitis C crónica, aunque no obstante es necesario una administración de tres veces por semana. El PEG-interferón alfa 2b es un conjugado covalente de interferón alfa 2b recombinante con monometoxi PEG en una proporción molar de 1:1 (Glue P et al., Clin Pharmacol Ther. 2000; 68; 556-567). La semivida media de absorción de PEG-interferón alfa 2b es 5 veces mayor que la del interferón alfa-2b no pegilado. La semivida media de eliminación es de 40 horas en pacientes con infección de hepatitis C. Otro producto es PEG-interferón alfa 2a, que presenta un molécula de cadena ramificada de 40 kDa con cada ramificación de PEG con un peso molecular de 20 kDa. Se unen las dos cadenas de monometoxi 2 PEG por medio de enlaces de uretano hidrolíticamente estables a una molécula de enlace de lisina, una en el grupo amino de la lisina alfa y la otra en el grupo amino de la lisina . La semivida media de absorción de PEG-interferón alfa 2a es 10 veces mayor que la del interferón alfa-2a no pegilado. La semivida media de eliminación es de aproximadamente 60 horas en pacientes con infección de hepatitis C. Ambos productos precisan ser administrados únicamente en un régimen de una vez por semana. Al tiempo que algunos conjugados de proteína-polímero son estables en forma líquida, otros no. Por ejemplo, a diferencia del caso de PEG-interferón alfa 2a en el que la pegilación da lugar a un enlace de uretano estable, que es fundamentalmente estable en medio acuoso, el producto PEG-interferón alfa 2b, que contiene PEG fundamentalmente unido a un residuo de histidina (His 34), es altamente inestable en forma líquida. Con dichos conjugados de proteína-polímero, es preciso usar técnicas tales como liofilización/secado por congelación un proceso en el que tiene lugar la sublimación de agua a partir de una composición tras congelación que puede proporcionar una forma estable del producto biológico durante un período de tiempo deseado. De este modo, para preparar una formulación de PEG-interferón alfa 2b, es necesario liofilizar con precaución la formulación con un crioprotector(es) o un lioprotector(es) apropiado, y estabilizadores, que estabilizan los conjugados de interferón alfa pegilados para evitar la des-pegilación durante y después de la liofilización un fenómeno comúnmente asociado con el producto de PEG-interferón alfa 2b. De manera adicional, además del crioprotector y de estabilizadores, la formulación liofilizada también contiene agentes que confieren volumen para aumentar la cantidad de material sólido en el frasco. Una forma específica para resolver el problema de inestabilidad del enlace de uretano al residuo de His 34 en el caso de PEG-interferón alfa 2b es mediante la utilización de una formulación que ha sido descrita en la patente de EE.UU. Nº. 6.180.096, en la que se someten a liofilizado conjugados de PEG-IFN alfa 2b en presencia de un tampón, crioprotectores, un estabilizador y un disolvente del cual dicha formulación contiene una sacarosa de disacárido, como crioprotector, junto con, fosfato de disodio monobásico dihidratado y fosfato de sodio dibásico anhídro como tampón, con polisorbato 80 como estabilizador, y agua como disolvente. Mientras la formulación anterior ha resultado exitosa desde el punto de vista comercial para el tratamiento de la hepatitis C, sin embargo se encuentra asociada a problemas graves, algunos de los cuales se presentan en otra solicitud de patente, WO 2006/020720, por... [Seguir leyendo]

1.- Una formulación que comprende un conjugado(s) PEG-interferón alfa, un tampón(es), un estabilizador(es), un crioprotector(es) y un disolvente, en la que dicho crioprotector es rafinosa. 2.- La formulación de las reivindicación 1, en la que el estabilizador se escoge entre SDS o polisorbatos apropiados. 3.- La formulación de la reivindicación 2, en la que el polisorbato se escoge entre polisorbato 20, 40 ó 80. 4.- La formulación de la reivindicación 1, en la que el tampón se escoge entre succinato apropiado, fosfato, histidina o tampones de glucinato, bien solos o en combinación. 5.- La formulación de la reivindicación 4, en la que el tampón se escoge entre succinato de sodio, succinato de potasio, fosfato de sodio, cloruro de histidina, glucinato de sodio, bien solo o en combinación. 6.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho tampón es succinato de sodio. 7.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el pH de dicha formulación se encuentra dentro del intervalo de 4,0-7,0. 8.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el crioprotector comprende además lactosa o trehalosa. 9.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la concentración de dichos conjugados de PEG-interferón alfa es de 0,03 a 2,0 mg de interferón alfa por ml. 10.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho estabilizador se encuentra presente en una concentración de 0,01 a 1,0 mg/ml. 11.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la concentración de tampón se encuentra dentro del intervalo de 0,001 a 1,0 M. 12.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la concentración de crioprotector se encuentra entre 10-100 mg/ml. 13.- La formulación que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho disolvente es agua. 14.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición además comprende glicina. 15.- La formulación de la reivindicación 14, en la que la concentración de glicina se encuentra entre 0,1-100 mg/ml. 16.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichos conjugados de PEG-interferón alfa comprenden de manera predominante moléculas de PEG conjugadas con moléculas sencillas de interferón alfa. 17.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas moléculas de interferón alfa se escogen entre el grupo que consiste en interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón alfa-2c o sus variantes apropiadas. 18.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas moléculas de interferón alfa son interferón alfa-2b. 19.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende PEG-interferón alfa-2b, rafinosa como crioprotector, Tween 80 como estabilizador, succinato de sodio como tampón y agua como disolvente. 20.- La formulación de la reivindicación 19, en la que el crioprotector además comprende lactosa o trehalosa. 21.- Un proceso de liofilización de la formulación que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para obtener un polvo liofilizado. 22.- Una formulación liofilizada preparada de acuerdo con el proceso de la reivindicación 21. 23.- Una formulación que consiste en conjugado(s) de PEF-interferón alfa, tampón(es), estabilizador(es), crioprotector(es) y un disolvente, en la que dicho crioprotector es rafinosa. 24.- La formulación de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polvo liofilizado se reconstituye con agua antes de la administración. 25.- Un proceso para preparar una formulación liofilizada de conjugados de PEG-interferón alfa que comprende, ES 2 365 832 T3 combinar dichos conjugados con un tampón apropiado, un estabilizador apropiado, un crioprotector apropiado y un disolvente, como en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho crioprotector es rafinosa y, posteriormente, liofilizar la mezcla para obtener un polvo liofilizado. 11