COMPOSICIONES PARA DESENCADENAR UNA RESPUESTA INMUNITARIA CONTRA MYCOBACTERIUM AVIUM SUBESPECIE PARATUBERCULOSIS.

Uso de una composición que comprende uno o más vectores de expresión para la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria en un rumiante contra M.

paratuberculosis; en el que el uno o más vectores de expresión comprenden al menos cinco secuencias polinucleotídicas aisladas que codifican antígenos de M. paratuberculosis, y en el que los vectores de expresión son capaces de expresar dichos antígenos de M. paratuberculosis; y en el que los antígenos de M. paratuberculosis son los antígenos de M. paratuberculosis 85A, 85B, 85C, proteína de 35 kDa de M. paratuberculosis y superóxido dismutasa (SOD)

La presente invención se refiere en general a la estimulación de respuestas inmunitarias, y más específicamente a composiciones y usos para estimular respuestas inmunitarias profilácticas y/o terapéuticas contra Mycobacterium 5 avium subespecie paratuberculosis.

La Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MPT) es el agente causante de la enfermedad de Johne (EJ), que causa enteritis granulomatosa crónica en rumiantes. Los animales afectados clínicamente desarrollan diarrea crónica y pérdida de peso progresiva que, dado el caso, da como resultado la muerte, mientras que los animales infectados subclínicamente principalmente tienen una producción reducida de leche. La EJ es de enorme 10 importancia económica para la industria láctea mundial, causando pérdidas importantes debido a la producción reducida y al sacrificio temprano de animales con estimaciones de un 20% de los rebaños lecheros de EE.UU. afectados y costes de 220 millones de dólares al año para la industria láctea (Wells, y col. 2000. J. Am. Vet. Med. Assoc. 216: 1450-1457). El ganado vacuno es más susceptible de infección por este organismo en los primeros 6 meses de vida, pero la enfermedad típicamente no se evidencia hasta los 3 a 5 años de edad. La infección ocurre 15 mediante la ingestión de estiércol contaminado, calostro o leche de vacas infectadas (Sweeney, 1996. Vet. Clin. N. Am. Food Anim. Pract. 12: 305-312). También ocurre infección fetal, particularmente en vacas preñadas con enfermedad avanzada (Sweeney, y col. 1992. Am. J. Vet. Res. 53: 477-480). Aunque la EJ es una enfermedad infecciosa importante de los rumiantes, no existe una vacuna eficaz contra esta enfermedad. La única vacuna disponible actualmente en los Estados Unidos consiste en M. avium subespecie paratuberculosis inactivada en un 20 coadyuvante oleoso (Kormendy, B. 1992. Acta Vet. Hung. 40: 171-184; Larsen, y col., 1978. Am. J. Vet. Res. 39: 65-69). Sin embargo, dichos programas de vacunación han generado graves problemas de salud pública. Por ejemplo, al menos un veterinario se inoculó accidentalmente en la mano durante la vacunación de animales (Patterson, y col., (1988) J. Am. Vet. Med. Assoc. 192: 1197-1199). Adicionalmente, los estudios han demostrado que hay una fuerte reacción en los sitios de inyección después de la vacunación con esta bacteria inactivada (Kormendy, B. 1992. Acta 25 Vet. Hung. 40: 171-184; Larsen, y col., 1978, Am. J. Vet. Res. 39: 65-69). Otra desventaja de esta vacuna es que los animales vacunados se vuelven positivos en la prueba cutánea de tuberculina (Kormendy, B. 1992. Acta Vet. Hung. 40: 171-184; Larsen, y col., 1978. Am. J. Vet. Res. 39: 65-69). Por tanto, existe la necesidad de desarrollar vacunas más eficaces contra la EJ que puedan usarse como composiciones profilácticas y/o terapéuticas seguras y eficaces para infección por MPT. 30

El documento WO 03/076898 describe diagnósticos de micobacterias.

Velaz-Faircloth y col. Infection and Immunity, vol. 67(8), agosto de 1999, páginas 4243-4250, describen la protección frente a M. avium por vacunas de ADN que expresan antígenos micobacterianos en forma de proteínas de fusión con GFP.

Uzonna J.E. y col., Vaccine, vol. 21, 2003, páginas 3101-3109, describen la eficacia de vacunaciones con la cepa 35 comercial y de campo M. paratuberculosis con IL-12 recombinante en un modelo de infección experimental bovina.

Mullerad J. y col., Med. Microbiol. Immunol., vol.190, 2002, páginas 179-187, describen la inmunogenicidad del antígeno 85B de M. paratuberculosis.

Shin y col. J. Vet. Sci. vol. 5(2), 2004, páginas 111-117, describen la respuesta de anticuerpos comparativa de cinco antígenos recombinantes con relación a los niveles de excreción bacteriana y el desarrollo de diagnóstico serológico 40 basado en el antígeno de 25 kDa de M. avium subespecie paratuberculosis.

Shin y col., Infect. Immun. vol. 73(8), agosto de 2005, páginas 5074-5085, describen las respuestas inmunitarias celulares in vitro ante antígenos recombinantes de M. avium subespecie paratuberculosis.

Dheenadhayalan y col., DNA Sequence, vol. 13(5), 2002, páginas 287-294, describen la clonación y caracterización de los genes que codifican los antígenos 85A, 85B y 85C de M. avium subespecie paratuberculosis. 45

La presente invención proporciona usos para estimular una respuesta inmunitaria en rumiantes contra M. paratuberculosis (MPT), como se define en las reivindicaciones. Las composiciones comprenden componentes inmunitarios, que son polinucleótidos que codifican antígenos de MPT, como se define en la reivindicación. Las composiciones comprenden al menos cinco componentes inmunogénicos recombinantes: los antígenos de MPT 85A, 85B, 85C, de 35kDa y superóxido dismutasa (SOD). Son otros antígenos de MPT ejemplares MptC, MptD y 50 proteína similar a ESAT-6.

El uso es para estimular una respuesta inmunitaria en un rumiante contra bacterias MPT.

Las composiciones que comprenden antígenos proteicos de MPT recombinantes, polinucleótidos de ADN que codifican antígenos de MPT o combinaciones de los mismos, pueden formularse con portadores farmacéuticos estándar y pueden ser para administración mediante cualquiera de una variedad de vías convencionales. Las 55

composiciones pueden ser para administración en cualquier momento a un rumiante susceptible de contraer infección por MPT o a un animal que esté infectado por MPT. Sin embargo, es preferible que las composiciones de la invención sean para administración antes de la infección por MPT, tal como para administración a rumiantes preñadas que pueden transferir componentes inmunogénicos profilácticos a sus crías mediante el calostro, o para administración durante el periodo de una a cinco semanas después del nacimiento. 5

La Fig. 1 es una representación gráfica de los datos del análisis de respuestas proliferativas de células mononucleares de sangre periférica de vacas infectadas y sanas de control estimuladas in vitro con 5 proteínas recombinantes de MPT. Los resultados se expresan como un índice de estimulación y las barras de error representan la desviación estándar de la media. No se observó una proliferación significativa ante ningún antígeno por PBMC de vacas no infectadas (P>0,05). Mostraron la mayor actividad proliferativa 85A y 10 la proteína de 35 kDa en animales de excreción baja y media, respectivamente.

La Fig. 2. es una representación gráfica de los datos del análisis de la producción de interferón γ en respuesta ante antígenos individuales con relación a los niveles de excreción de MPT. Los resultados se dan como valores de DO en pocillos estimulados–valores de DO en pocillos de control (IFN-γ producido naturalmente). Las barras de error representan las desviaciones estándar de las medias. 85A y 85B eran los antígenos más 15 inducibles a producir IFN-γ en células mononucleares de sangre periférica bovina a partir de animales con ambos tipos de excreción.

La Fig. 3. es una representación gráfica de los datos del análisis de las respuestas de anticuerpo ante antígenos individuales con relación a los valores de excreción de MPT. Las barras representan los valores medios de DO a 405 nm. Las barras de error representan las desviaciones estándar de las medias. Todos los antígenos 20 recombinante mostraron aumentos de las respuestas de anticuerpo según los niveles de excreción y las respuestas de anticuerpo ante la proteína de 35 kDa estaban positivamente separados entre las vacas sanas no infectadas y con ambos tipos de excreción (P<0,01).

Las Fig. 4A-4D son representaciones gráficas de los datos del análisis de los cambios en la distribución de subconjuntos de linfocitos T en linfocitos de sangre periférica bovina después de estimulación con antígenos 25 recombinantes, como se determina mediante análisis por FACS. Fig. 4A. CD4; Ag 85A y Ag 85B inducían una mayor proporción de linfocitos T CD4+ en animales de excreción media en comparación con animales de excreción baja, mientras que el porcentaje de linfocitos CD4+ no cambiaba en el ganado vacuno de control no infectado. Fig. 4B. CDB; Ag 85A aumentaba la proporción de linfocitos T CD8+ en animales de excreción media, mientras que el porcentaje aumentado de linfocitos CD8+ era muy bajo en ganado vacuno no 30 infectado. Fig. 4C. CD25; Ag 85A y Ag85B aumentaban la proporción de linfocitos T CD25+ en ambos grupos de excreción, mientras que tenían poco efecto en ganado vacuno no infectado. En contraposición, Ag 85C y la proteína de 35 kDa aumentaban... [Seguir leyendo]

1. Uso de una composición que comprende uno o más vectores de expresión para la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria en un rumiante contra M. paratuberculosis;

en el que el uno o más vectores de expresión comprenden al menos cinco secuencias polinucleotídicas aisladas que codifican antígenos de M. paratuberculosis, y en el que los vectores de expresión son capaces de expresar dichos 5 antígenos de M. paratuberculosis; y

en el que los antígenos de M. paratuberculosis son los antígenos de M. paratuberculosis 85A, 85B, 85C, proteína de 35 kDa de M. paratuberculosis y superóxido dismutasa (SOD).

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el rumiante es un animal bovino, una oveja, una cabra, un ciervo o un alce. 10

3. Uso según la reivindicación 2, en el que el rumiante es animal bovino.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el rumiante no está infectado por M. paratuberculosis.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el rumiante está infectado por M. paratuberculosis.

6. Uso según la reivindicación 3, en el que el animal bovino tiene la enfermedad de Johne.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el animal está preñado. 15

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la composición comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que la composición comprende adicionalmente un coadyuvante.

10. Una composición que comprende uno o más vectores de expresión para uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria contra M. paratuberculosis en un rumiante; 20

en la que el uno o más vectores de expresión comprenden al menos cinco secuencias polinucleotídicas aisladas que codifican antígenos de M. paratuberculosis, en la que los vectores de expresión son capaces de expresar dichos antígenos de M. paratuberculosis; y

en la que los antígenos de M. paratuberculosis son los antígenos de M. paratuberculosis 85A, 85B, 85C, proteína de 35 kDa de M. paratuberculosis y superóxido dismutasa (SOD). 25

11. La composición de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

12. La composición de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente un coadyuvante.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o de una composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la composición comprende un vector de expresión que comprende dichas al menos 30 cinco secuencias polinucleotídicas aisladas, en el que dicho vector de expresión es capaz de expresar dichos al menos cinco antígenos de M. paratuberculosis.

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o de una composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la composición comprende al menos cinco vectores de expresión, en el que cada uno de dichos al menos cinco vectores de expresión comprende una diferente de dichas al menos cinco secuencias 35 polinucleotídicas aisladas, y en el que cada uno de dichos al menos cinco vectores de expresión es capaz de expresar uno diferente de dichos al menos cinco antígenos de M. paratuberculosis.