Un método para el aislamiento por afinidad o ensayo por afinidad de una especie,

que comprende:

(a) proporcionar, en una disolución, microburbujas de albúmina revestidas con una molécula de afinidad que se une específicamente a una especie;

(b) poner las microburbujas, en una disolución, en contacto con la especie que interacciona con la molécula de afinidad que reviste las microburbujas, generándose de este modo microburbujas revestidas con la especie;

(c) dejar que las microburbujas revestidas con la especie floten en la parte superior de la disolución, separándose de este modo las microburbujas revestidas con la especie, de la especie libre y la disolución; y

(d) destruir las microburbujas tratando con un detergente o agente tensioactivo las microburbujas revestidas con la especie.

Microburbujas para separación por afinidad Este invento se refiere a métodos para aislamiento por afinidad y un ensayo por afinidad basados en microburbujas de albúmina revestidas con una molécula de afinidad.

ANTECEDENTES DEL INVENTO

En el campo del aislamiento de células, virus, bacterias y moléculas solubles se han usado diversos tipos de partículas como fase sólida para absorber, o unirse a, la diana de interés. Por ejemplo, unas partículas magnéticas, cuando están revestidas con un ligando, tal como un anticuerpo, se pueden unir a una proteína soluble o célula diana. La diana unida sobre la partícula magnética efectúa una separación de la diana, de otros tipos celulares o proteínas. Ha habido diversas mejoras de este trabajo original y se ha dispuesto durante años de ejemplos comerciales.

Otros han utilizado partículas de látex, liposomas, glóbulos de grasa de leche, partículas de plástico tales como poliestireno y polietileno y polipropileno, nailon, etc. Como soportes para la captura, cada uno de estos tiene sus propios atributos y problemas particulares. La unión inespecífica de proteínas y células no diana es el problema más común con que se encuentran estos métodos, lo que da lugar a una separación imperfecta. Además, la mayoría de los métodos requieren al menos una operación adicional después de la unión para efectuar la separación de la especie no unida de la unida a la partícula; por ejemplo, para las partículas magnéticas se debe aplicar un campo magnético, y a veces se usa una centrifugación para separar las partículas de la disolución o se usa una filtración para separar las partículas de la disolución.

En general, el tiempo requerido para que se unan las proteínas o células diana está relacionado con la superficie específica de las partículas y con la cantidad de partículas por unidad de volumen de la disolución. Cuanta más pequeña es la partícula, más rápida es la unión a causa de su superficie específica aumentada. Desafortunadamente, una mayor superficie específica aumenta generalmente la unión inespecífica.

Los métodos de separación, dependiendo de la naturaleza o principio de la separación, pueden conducir al aislamiento conjunto de partículas diferentes. Esto es evidente en las separaciones basadas en la centrifugación por gravedad, en la que pueden sedimentar conjuntamente partículas y células u otras especies. Además, ciertos tipos celulares, tales como macrófagos y monocitos, pueden ingerir inespecíficamente las partículas y pueden ser aislados junto con las células diana. Aunque las limitaciones individuales de la tecnología previa pueden ser minimizadas o evitadas realizando ciertas operaciones o tomando ciertas precauciones, ciertas limitaciones son inherentes y no pueden ser totalmente superadas. El hecho de que haya muchos planteamientos diferentes con diversos grados de éxito sugiere que se necesita una mejor solución para el problema.

El agente de separación óptimo tendría una superficie específica infinita con una interacción inespecífica nula para que la unión se produjera instantáneamente y se minimizara la unión a moléculas solubles o células no diana. Idealmente, el propio agente debería separarse de la suspensión celular o la disolución de moléculas solubles sin atrapar células ni moléculas no diana, respectivamente.

En el Documento US 2003/104359 se describe el uso de microburbujas proteicas para un aislamiento por afinidad o ensayo por afinidad mediante los cuales se pueden destruir las microburbujas aplicando presión o vacío o mediante un cambio del pH.

SUMARIO DEL INVENTO

El presente invento proporciona un método para el aislamiento por afinidad o ensayo por afinidad de una especie, que comprende:

(a) proporcionar, en una disolución, microburbujas de albúmina revestidas con una molécula de afinidad que se une específicamente a una especie;

(b) poner las microburbujas, en una disolución, en contacto con la especie que interacciona con la molécula de afinidad que reviste las microburbujas, generándose de este modo microburbujas revestidas con la especie;

(c) dejar que las microburbujas revestidas con la especie floten en la parte superior de la disolución, separándose de este modo las microburbujas revestidas con la especie, de la especie libre y la disolución; y

(d) destruir las microburbujas tratando con un detergente o agente tensioactivo las microburbujas revestidas con la especie.

Las microburbujas pueden ser formadas mediante la introducción de un gas en una disolución de albúmina, por ejemplo, por sonicación. El gas se puede introducir en la albúmina por medio de un proceso que comprende calentar una disolución de albúmina. En otra realización, las microburbujas de albúmina pueden ser estabilizadas, por ejemplo, por desnaturalización de la albúmina o tratamiento con Cr+++.

De acuerdo con el invento, la molécula de afinidad puede ser un receptor, un ligando o un anticuerpo. Alternativamente, la molécula de afinidad puede ser biotina, avidina o estreptavidina.

La molécula de afinidad se puede copular directamente con la microburbuja usando, por ejemplo, un reactivo heterobifuncional tal como 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo. En otra realización del invento, la molécula de afinidad se copula indirectamente con la microburbuja, tal como a través de la interacción de al menos otro molécula. En un aspecto del invento, se copula directamente la microburbuja con estreptavidina y se biotinila la molécula de afinidad, de modo que la estreptavidina y la biotina interaccionan para copular la molécula de afinidad con la microburbuja.

En una realización, la molécula de afinidad se copula a través de un grupo funcional amina presente en la microburbuja.

En una realización, la especie es un receptor, un ligando o un antígeno. En una realización, la especie es un analito. En realizaciones alternativas, la especie es un virus o una célula.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO

Se ha de entender que tanto la descripción general precedente como la descripción detallada siguiente son sólo ejemplares y explicativas y no son restrictivas del invento reivindicado. Como aquí se utiliza, el uso del singular incluye el plural a menos que se afirme específicamente otra cosa. Como aquí se utiliza, "o" significa "y/o" a menos que se afirme otra cosa. Además, el uso de la expresión "que incluye", así como de otras formas tales como "incluye" e "incluido", no es restrictivo. Como aquí se utiliza, "puede" significa "podría" a menos que se afirme otra cosa.

Los encabezamientos de sección aquí usados son solamente con fines de organización y no han de ser considerados restrictivos del contenido descrito.

Definiciones

Antes de seguir adelante con una descripción de las realizaciones específicas del presente invento, se definirán y describirán diversos términos con detalle.

A menos que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas utilizadas al respecto y los procedimientos, técnicas y métodos de laboratorio aquí descritos son aquellos conocidos en la técnica a la cual pertenecen. Se usan indistintamente símbolos químicos y abreviaturas estándares con los nombres completos representados por dichos símbolos. De este modo, por ejemplo, se entiende que los términos "carbono" y "C" tienen un significado idéntico. Se pueden usar técnicas estándares para las síntesis químicas, las modificaciones químicas, los análisis químicos, la preparación, formulación y distribución farmacéuticas y el tratamiento de pacientes. Se pueden usar técnicas estándares para la metodología de DNA recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, el cultivo tisular, y similares. Se pueden llevar a cabo reacciones y técnicas de purificación usando, por ejemplo, kits de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se lleva normalmente a cabo en la técnica o como aquí se describe. Las técnicas y procedimientos precedentes se pueden llevar generalmente a cabo de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales o más específicas que se citan y discuten por toda la memoria descriptiva. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecule Cloning: A Laborator y Manual" (2ª edición, Cold Spring Harbor Laborator y Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) , y Harlow y Lane, "Antibodies: A Laborator y Manual" (Cold Spring Harbor Laborator y Press, Cold Spring Harbor,... [Seguir leyendo]

1. Un método para el aislamiento por afinidad o ensayo por afinidad de una especie, que comprende:

(a) proporcionar, en una disolución, microburbujas de albúmina revestidas con una molécula de afinidad que se une específicamente a una especie;

(b) poner las microburbujas, en una disolución, en contacto con la especie que interacciona con la molécula de afinidad que reviste las microburbujas, generándose de este modo microburbujas revestidas con la especie;

(c) dejar que las microburbujas revestidas con la especie floten en la parte superior de la disolución, separándose de este modo las microburbujas revestidas con la especie, de la especie libre y la disolución; y

(d) destruir las microburbujas tratando con un detergente o agente tensioactivo las microburbujas revestidas con la especie.

2. El método de la Reivindicación 1, en que la destrucción de las microburbujas genera una disolución que contiene la especie.

3. El método de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, en que la molécula de afinidad es seleccionada del grupo que consiste en: un receptor, un ligando y un anticuerpo, o en que la molécula de afinidad es biotina, o en que la molécula de afinidad es avidina o estreptavidina.

4. El método de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, en que la especie es un receptor, un ligando o un antígeno, o en que la especie es una analito, o en que la especie es un virus o una célula o un subcomponente de la misma.

5. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 y 2, que comprende además centrifugar las microburbujas y la disolución, por lo que la especie sedimenta bajo la fuerza de la gravedad, potenciándose de este modo la separación de las microburbujas revestidas con la especie, de la especie libre y la disolución.

6. El método de la Reivindicación 1 ó 2, en que la especie está modificada con biotina, avidina o estreptavidina.

7. El método de la Reivindicación 1, en que la destrucción de las microburbujas permite el aislamiento de la especie diana desprovista de las microburbujas de captura.

8. El método de la Reivindicación 1, en que la albúmina es seleccionada entre albúmina sérica humana (HSA) y albúmina sérica bovina (BSA) .