Preparación de superficies funcionalizadas de sustratos de poliestireno.

Esta invención describe la preparación de superficies de poliestireno modificadas químicamente con una gran variedad de grupos funcionales. Se trata de una modificación en mojado que se lleva a cabo en dos pasos. En el primer paso se activa la superficie al crear grupos clorosulfonilos sumergiendo los sustratos de poliestireno en una disolución de ácido clorosulfónico a bajas temperaturas. Después de ser lavado, el sustrato modificado se sumerge en una disolución acuosa que contiene un compuesto bifuncional siendo uno de los grupos funcionales una amina alifática primaria que sirve de anclaje a la superficie mediante un enlace covalente de una sulfonamida. El segundo grupo funcional queda disponible en la superficie modificada y puede servir para inmovilizar biomoléculas al crear una conexión covalente, o para ajustar parámetros superficiales como la humectabilidad o adhesión.La calidad óptica de las muestras se mantiene inalterada durante la modificación lo que permite el uso de las superficies modificadas como herramienta idónea para ensayos diagnósticos de tipo ELISA o chips ADN

Preparación de superficies funcionalizadas de sustratos de poliestireno.

Sector de la técnica

Esta invención describe un método para producir de una manera simple y económica superficies de poliestireno activadas y la posterior preparación específica de superficies con una amplia variedad de grupos funcionales como grupos amina (primarias, secundarias y terciarias), grupos carboxílicos, grupos sulfónico, sulfonazidas o ésteres metílicos con una excelente calidad óptica y su aplicación en ensayos diagnósticos en los sectores biomédicos y farmacológicos.

Estado de la técnica

En las últimas décadas la comunidad científica de las áreas biológicas, clínicas y farmacéuticas han reconocido que los microensayos son herramientas muy útiles para altos rendimientos en la determinación de una variedad de interacciones y funciones biológicas y bioquímicas. Los microensayos sobre soportes u otros formatos, por ejemplo, pueden ayudar a reducir el consumo de agentes costosos o limitados, usados para la analítica biológica o bioquímica. Se acepta de forma generalizada que el formato del microensayo se mantendrá como herramienta clave en un futuro previsible. Aplicaciones para la tecnología de microensayos van a seguir expandiéndose a las áreas del descubrimiento y desarrollo de fármacos, detección química, diagnóstico e investigación básica.

Por estas razones el desarrollo de un material de fase sólida que garantiza una bioactividad óptima sin pérdida de biomoléculas, es un objetivo común de científicos, laboratorios clínicos y fabricantes de kits diagnósticos. Hasta la actualidad, se han descrito en la bibliografía varios métodos para el anclaje covalente de moléculas en soportes sólidos previamente activados. Los polímeros también se han convertido en un material de soporte atractivo porque pueden ser unidos fácilmente por vía química o física con biomoléculas como enzimas, anticuerpos y fosfolípidos para formar sistemas biológicamente funcionales. Una ventaja particular al usar polímeros es que se pueden llevar a cabo los microensayos de una manera económica y en gran número lo que hace especialmente atractivo su uso en aplicaciones comerciales.

Por lo general, superficies poliméricas son hidrófobas y bastante poco reactivas. Para inmovilizar biomoléculas en superficies poliméricas sólidas a través de enlaces covalentes o iónicos hay que modificar químicamente de forma previa la superficie introduciendo grupos reactivos. La selección de la fase sólida polimérica es frecuentemente influenciada por la disponibilidad de una instrumentación compatible y sistemas de automatización. El poliestireno es uno de los materiales poliméricos de mayor uso en el sector biomédico porque tiene una claridad óptica excelente, es fácilmente moldeable y relativamente económico. Placas de poliestireno y placas multi-pocillo tienen una aceptación cada vez mayor, en parte porque los procesos de pipetear, lavar y detectar la señal son fáciles de automatizar. Otras ventajas incluyen la posibilidad de analizar múltiples muestras simultáneamente y la compatibilidad con un gran número de sistemas de detección diferentes (por ejemplo por calorimetría, fluorescencia y quimioluminiscencia). Ya en los años setenta se usaban microplacas de este polímero como recipientes de reacción para ensayos ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) que requieren superficies capaces de inmovilizar proteínas y otras biomoléculas.

Sin embargo, el Poliestireno también tiene un gran inconveniente: es un polímero muy hidrófobo y con una baja humectabilidad y el anclaje de células y otras muchas biomoléculas resulta difícil. Afortunadamente la superficie del poliestireno puede ser fácilmente modificada. Por diferentes métodos de tratamientos químicos y físicos es posible anclar una gran variedad de grupos químicos como hidroxi, cetona, aldehido, carboxi y grupos amina al polímero que permiten el anclaje covalente de diferentes grupos reactivos para la posterior inmovilización covalente de biomoléculas. Tratamientos típicos de la superficie del poliestireno emplean descargas corona y deposición de vapores químicos así como la ozonación en fase gas y en presencia de irradiación con luz UV. Estos métodos se han empleado extensamente para mejorar la humectabilidad y las propiedades de adhesión de superficies poliméricas. Otro método convencional para modificar superficies de poliestireno con grupos amina es la polimerización por plasma de alilamina o tratamientos por plasma en presencia de N2 o NH3. Las superficies de PS modificadas de esta manera se emplean con entrecruzantes bifuncionales (por ejemplo glutaraldehido, carbodiimida) para acoplar biomoléculas covalentemente y conseguir así su inmovilización.

Empleando una tecnología para la modificación fotoquímica [Producing low binding hydrophobic surfaces by treating with a low HLB number non-ionic surfactant. Bookbinder Dana Craig [US]; Fewkes Jr. Edgard John [US]; Griffin James Arthur [US]; Smith Francés M [US]; Tennent David, Patent number: US6093559], el Grupo Corning fue capaz de preactivar placas multipocillos de poliestireno para la inmovilización específica y covalente de biomoléculas. Este anclaje de grupos reactivos produce las siguientes superficies estables:

- la superficie con grupos N-oxisuccinimida (NOS) que es capaz de reaccionar con grupos amina,

- la superficie con grupos maleimidas para el acoplamiento covalente de biomoléculas portadoras de grupos SH,

- la superficie con grupos hidrazidas que es reactiva hacia carbohidratos activados con periodatos,

- superficies aminadas para el anclaje covalente de biomoléculas portadores de grupos COOH.

J.D. Page et. al. [J.D. Page, R. Durango, A.E. Huang, Chemical modification of PS surface and its effect on immobilized antibodies, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects Vol.132, 193, (1998)] por otro lado desarrolló métodos de modificación química en mojado de partículas de PS con el fin de obtener partículas de copolímeros aminados y macroporosos a base de estireno y divinilbenzeno. En este trabajo se somete el PS entrecruzado en el primer paso a una nitración aromática clásica. En un segundo paso se reducen los grupos nitro empleando SnCl2/HCl para formar grupos amina aromáticos primarios.

Otro método en mojado para la aminación de multi-pocillos fue propuesto por Zammatteo [N. Zammatteo, C. Girardeaux, D. Delforge, Amination of PS microwells: application to the covalent grafting of DNA Probes for Hybridization Assays. Analytical Biochemistry Vol 236, 85, (1996)]. En este trabajo se oxida en un primer paso el sustrato polimérico empleando permanganato potásico, creando grupos carboxílicos que reaccionan en un segundo paso con una diamina alifática, creando una superficie aminada. La cantidad de grupos amina formados era del orden de magnitud de picomoles/cm².

La presente invención tiene varias ventajas en comparación con los procedimientos arriba descritos para la preparación de sustratos funcionalizados a base de PS. Por un lado permite obtener superficies homogéneas con un número controlable de grupos funcionales que es de entre uno y dos ordenes de magnitud mayor que el que se consigue convencionalmente por tratamientos con plasma o UV. Por otro lado, las superficies obtenidas tienen una calidad óptica excelente con un alto grado de transparencia. Por último, el tratamiento químico en mojado en dos pasos descrito en esta patente produce selectivamente y reproduciblemente solo el grupo funcional preseleccionado.

Descripción de la invención

Un aspecto de la presente invención es el procedimiento de obtención de poliestireno modificado con grupos clorosulfonilo que comprende las siguientes etapas:

a) enfriamiento de una solución de ácido clorosulfónico puro en atmósfera inerte a baja temperatura.

b) introducción en la solución a) de un sustrato de poliestireno entre 0 y 3 horas, preferiblemente 30 minutos

c) extracción del sustrato y posterior lavado en un baño de ácido concentrado durante un tiempo entre 0 y 10 min.

d) lavado del sustrato modificado en un baño de agua/hielo entre 0 y 5 min. preferiblemente 30 segundos y posterior secado.

Un aspecto preferente de la presente invención es que con el procedimiento de obtención de la invención se obtiene poliestireno modificado con grupos clorosulfonilos que conserva las propiedades ópticas de transparencia del poliestireno transparente de partida.

1. Procedimiento de obtención de poliestireno modificado con grupos clorosulfonilo que comprende las siguientes etapas:

a) enfriamiento de una solución de ácido clorosulfónico puro en atmósfera inerte a baja temperatura.

b) introducción en la solución a) de un sustrato de poliestireno entre 0 y 3 horas, preferiblemente 30 minutos

c) extracción del sustrato y posterior lavado en un baño de ácido concentrado durante un tiempo entre 0 y 10 min.

d) lavado del sustrato modificado en un baño de agua/hielo entre 0 y 5 min. preferiblemente 30 segundos y posterior secado

y esta caracterizado porque:

• en la etapa a) la temperatura está entre -20ºC y 20ºC,

• en la etapa c) el ácido utilizado es ácido sulfúrico y

• en la etapa c) la temperatura del lavado en baño ácido es entre -20 y 10ºC.

2. Procedimiento de obtención de poliestireno modificado con grupos clorosulfonilo según reivindicación 1 en que la temperatura de la etapa a) es de -10ºC.

3. Procedimiento de obtención de poliestireno modificado con grupos clorosulfonilo según reivindicación 1 en que la temperatura de la etapa c) es de -10ºC.

4. Procedimiento de obtención de poliestireno modificado con grupos clorosulfonilo según reivindicación 1 caracterizado porque el sustrato de poliestireno introducido en la etapa b) es transparente.

5. Poliestireno modificado con grupos clorosulfonilos según reivindicación 4 caracterizado porque conserva las propiedades ópticas del poliestireno transparente.

6. Uso del poliestireno modificado con grupos clorosulfonilos obtenido mediante el proceso descrito en las reivindicaciones 1 a la 5, como intermedio en reacciones de obtención de poliestireno funcionarizado.

7. Uso del poliestireno modificado con grupos clorosulfonilo según reivindicación 6 que reacciona con alcanos disustituídos que contengan un grupo amina alifático primario para la preparación de derivados de poliestireno funcionalizados a través de enlaces sulfonamidas según fórmula (III), donde

• -R es un grupo funcional seleccionado del grupo que comprende un amino (NH2), un Bromuro (Br), un carboxílico (COOH) un éster alquílico (COOCH3), un grupo morfolina ó un hidrógeno (H);

• -y x toma un valor de entre 0 y 12

8. Uso del poliestireno modificado con grupos clorosulfonilo según reivindicación 6 en el que el poliestireno se funcionaliza con grupos sulfónicos según fórmula (IV)

9. Uso del poliestireno modificado con grupos clorosulfonilo según reivindicación 6 en el que el poliestireno se funcionaliza con grupos sulfonazidas según fórmula (V)

10. Sustratos modificados según reivindicaciones 8, 9 y 7 caracterizados porque los poliestirenos modificados según fórmulas (III) (IV) y (V) conservan sus propiedades ópticas de transparencia.

11. Uso de los sustratos de poliestireno modificados según fórmula (III), (IV) y (V) para el acoplamiento de biomoléculas.

12. Uso de los sustratos de poliestireno modificados según reivindicación 11 en el que las biomoléculas son anticuerpos.

13. Uso de los sustratos de poliestireno modificados según reivindicación 11 en el que las biomoléculas son enzimas.