CITOQUINAS MULTIFUNCIONALES.

Proteína de fusión con la fórmula: X-Y, en la que X representa IL-2 e Y representa IL-18

La presente invención se refiere a una proteina de fusión nueva con la fórmula X-Y, en la que X

representa IL-2 e Y representa IL-18.

La presente invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión y a un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico. La presente invención también da a conocer partículas virales infecciosas y células huésped que comprenden dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector, así como un proceso para preparar dichas partículas virales infecciosas. La presente invención también da a conocer un método para preparar de manera recombinante dicha proteína de fusión. Finalmente, la presente invención también da a conocer una composición farmacéutica que comprende dicha proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico, un vector, partículas virales infecciosas y una célula huésped, así como la utilización terapéutica de los mismos.

La presente invención es útil, de manera particular, en el campo de la terapia génica y la inmunoterapia, especialmente para el tratamiento o la prevención de un conjunto de enfermedades, que incluyen cánceres y enfermedades infecciosas (infecciones por bacterias y virus).

De forma general, las respuestas inmunes del huésped se encuentran en dos categorías: no específicas (o innatas) y específicas (o adaptativas o adquiridas). La diferencia entre éstas es que una respuesta inmune específica es altamente específica para un antígeno concreto, mientras que una respuesta no específica no depende de la exposición repetida a un patógeno/antígeno determinado. Las redes que controlan el sistema inmune dependen de las proteínas secretadas (por ejemplo, citoquinas) para activar y desactivar las funciones de las células inmunes, así como para regular su proliferación y para controlar la magnitud de la respuesta inmune. De manera específica, dos tipos de linfocitos, células B y células T, se encuentran en el núcleo de la inmunidad específica. Después de la liberación por un antígeno, las células B se dividen y las células hija sintetizan y secretan moléculas de anticuerpo (inmunidad humoral). La activación de las células T implica el desarrollo de la inmunidad mediada por células, mediada entre otros por linfocitos T citotóxicos (CTL) que eliminan de manera específica células diana no portadoras de auto-antígenos (por ejemplo, células infectadas o tumorales). La activación de una respuesta inmune específica (o adaptativa) está orquestada por numerosas citoquinas. Particularmente importantes son las interleuquinas (IL)-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-15 e interferón gamma (IFNg). Por otro lado, las respuestas no específicas (innatas) implican diferentes tipos de células inmunes, incluyendo células asesinas (“killer”) naturales (NK), células T Asesinas Naturales (NKT), células dendríticas (DCs) y macrófagos, y están, entre otras, mediadas por la secreción de citoquinas, tales como IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21. En realidad, sin embargo, la diferencia estricta entre las respuestas inmunes específica y no específica es algo arbitraria, ya que la eliminación de patógenos y tumores in vivo es probable que implique que ambos tipos de respuesta inmune actúan de manera conjunta. Además, a través de los mecanismos de señalización de las citoquinas, los efectores específicos pueden jugar un papel principal en la inducción y activación de efectores no específicos y viceversa. Por ejemplo, una propiedad sorprendente de las células NKT es su capacidad de producir rápidamente grandes cantidades de citoquinas en respuesta al acoplamiento de receptores de células T, sugiriendo que las células NKT activadas también pueden modular respuestas inmunes específicas. Para una discusión general de la respuesta inmune, células efectoras inmunes y mediadores inmunes, véase, por ejemplo, las ediciones más actualizadas de “Encyclopedia of Immunology” (Editada por Ivan Roitt y Peter Delves; Academic Press Limited) y “Fundamental Immunology” (por ejemplo, 2ª Edición, editada por W. Paul; Raven Press).

En general, se acepta que el cáncer es un proceso de múltiples etapas que resulta de una pérdida del control de la multiplicación celular. Existe un gran cúmulo de investigaciones que apoyan la implicación de antígenos asociados a tumores (TAA) en la aparición del fenotipo maligno. Estos antígenos incluyen productos de oncogenes (por ejemplo, p53, ras, neu, erb), productos génicos embrionarios reactivados (por ejemplo, P91A hallado en el mastocitoma P815), autoantígenos modificados (por ejemplo, MUC-1 hiperglicosilado), genes virales oncogénicos (por ejemplo, antígenos tempranos del virus del papiloma) y un conjunto de otros. Con respecto al mecanismo que actúa en el reconocimiento y la eliminación de células tumorales, se ha observado que los linfocitos T desempeñan un papel clave para conferir especificidad al rechazo del tumor. En particular, se identificaron los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ como células efectoras importantes para reconocer antígenos tumorales específicos. Los CTL pueden eliminar tumores sólo después de haber sido sensibilizados previamente para un antígeno tumoral y sólo cuando son presentados en la superficie celular por productos génicos de MHC de clase I. En muchos casos, la inducción de la respuesta antitumoral también depende de la presencia de células T CD4+. Además de estas células efectoras inmunes específicas, se han identificado funciones en el rechazo tumoral para las células NK y otras células efectoras no específicas, tales como NKT y macrófagos, que pueden lisar células tumorales de una manera que no es dependiente de antígeno y no está limitada a MHC.

A pesar del hecho de que la amplia mayoría de antígenos asociados a tumores son capaces de ser reconocidos como exógenos por el sistema inmune del paciente y la abundancia de mecanismos inmunes tumoricidas, la mayoría de cánceres no provocan respuestas inmunológicas suficientes para controlar el crecimiento de células malignas. Las células tumorales han desarrollado diversos mecanismos que les permiten escapar de la inmunidad del huésped debido a una reducción en la presentación de antígenos por las células tumorales o debido a una disminución generalizada en la inmunidad del paciente. Como la expresión de los determinantes de MHC de clase I en la superficie celular es esencial para el reconocimiento de antígenos exógenos por los CTL, la supresión o fracaso en la expresión de antígenos de MHC de clase I es uno de los mecanismos descritos utilizados por las células tumorales para eludir el sistema inmune (Tanaka y otros, 1988, Ann. Rev. Immunol. 6, 359-380). Otro mecanismo de la anergia inmune implica la liberación de antígenos tumorales, evitando de este modo la interacción de las células inmunes con la propia célula diana tumoral. Además, los tumores pueden activar moléculas inmunosupresoras para disminuir la fuerza de las respuestas inmunes a los antígenos tumorales o para activar la apoptosis de células efectoras inmunes. Por ejemplo, IL-2 puede tener en algunas circunstancias, un papel crítico en el mantenimiento de la tolerancia periférica. Como resultado de su papel fundamental en la muerte celular inducida por activación (AICD), las células T generadas en respuesta a vacunas tumorales que contienen IL-2 pueden interpretar las células tumorales como propias y las células T reactivas al tumor pueden ser eliminadas por la apoptosis inducida por AICD (Lenardo, 1996, J. Exp. Med. 183, 721-724). Además, la IL-2 mantiene las células T reguladoras negativas CD4+CD25+ y se ha descrito que terminan la persistencia de células T de memoria CD8+ (Shevach, 2000, Ann. Rev. Immunol. 18, 423-449).

Un conjunto de estudios han descrito un papel crítico para las células CD4(+) específicas de tumor en el aumento de mecanismos efectores inmunoterapéuticos. Sin embargo, la estimulación crónica de dichas células T CD4(+) a menudo conduce a la regulación hacia arriba de tanto Fas como el ligando de Fas, y la coexpresión de estas moléculas puede dar lugar potencialmente a la muerte celular inducida por activación (AICD) y la posterior pérdida de la respuesta antitumoral. En cambio, la resistencia a AICD aumenta de manera significativa la actividad efectora de células T (Saff y otros, 2004, J. Immunol. 172, 6598-6606).

Un conjunto de estrategias previas han utilizado citoquinas para aumentar la inmunidad del huésped y, de este modo, para superar el estado inducido por el tumor de anergia inmune. Por ejemplo, la IL-2 humana (Proleuquina) es un agente terapéutico aprobado para el cáncer metastático... [Seguir leyendo]

1. Proteína de fusión con la fórmula: X-Y, en la que X representa IL-2 e Y representa IL-18.

2. Proteína de fusión, según la reivindicación 2, en la que dicha IL-2 es una variante de IL-2 seleccionada del grupo que comprende:

(a) la variante F42K que tiene el residuo de fenilalanina en la posición 42 de la IL-2 nativa sustituido por un residuo de lisina;

(b) la variante R38A que tiene el residuo de arginina en la posición 38 de la IL-2 nativa sustituido por un residuo de alanina;

(c) la variante D20I que tiene el residuo de ácido aspártico en la posición 20 de la IL-2 nativa sustituido por un residuo de isoleucina;

(d) la variante N88G que tiene el residuo de asparagina en la posición 88 de la IL-2 nativa sustituido por un residuo de glicina;

(e) la variante N88R que tiene el residuo de asparagina en la posición 88 de la IL-2 nativa sustituido por un residuo de arginina;

(f) la variante Q126M que tiene el residuo de glutamina en la posición 126 de la IL-2 nativa sustituido por un residuo de metionina; y

(g) cualquier combinación de (a) a (f).

3. Proteína de fusión según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha IL-18 es una variante de IL-18 seleccionada del grupo que comprende:

(a) la variante E42A que tiene el residuo de ácido glutámico en la posición 42 de la IL-18 nativa sustituido por un residuo de alanina;

(b) la variante K89A que tiene el residuo de lisina en la posición 89 de la IL-18 nativa sustituido por un residuo de alanina; y

(c) una variante que combina ambas sustituciones de (a) y (b).

4. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha IL-18 es una proIL-18.

5. Proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es, como mínimo, el 70% idéntica con la secuencia de aminoácidos indicada en las SEC ID NO: 8 a 15.

6. Proteína de fusión, segú la reivindicación 5, en la que dicha proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es el 100% idéntica con la secuencia de aminoácidos indicada en las SEC ID NO: 8 a

15.

7. Molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Vector que contiene la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7.

9. Vector, según la reivindicación 8, en el que dicho vector deriva de uno o más plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas de levadura, cromosomas artificiales, o de virus seleccionados del grupo que comprende baculovirus, papovavirus, virus del herpes, adenovirus, virus asociados a adenovirus (AAV), poxvirus, virus espumosos y retrovirus.

10. Vector, según la reivindicación 9, en el que dicho vector es un vector adenoviral.

11. Vector, según la reivindicación 10, en el que dicho vector es un vector adenoviral defectuoso en la replicación con E1 y E3 eliminadas que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7 insertada en sustitución de la región E1 y situada bajo el control del promotor de CMV.

12. Vector, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que dicho vector comprende además uno o más transgenes que codifican (i) un inhibidor de la proliferación de tumores y/o (ii) como mínimo, un antígeno contra el que se desea una respuesta inmune.

13. Vector, según la reivindicación 12, en el que dicho inhibidor de la proliferación de tumores es una proteína de fusión que codifica una enzima de dos dominios que posee las actividades de citosín desaminasa y uracil fosforibosil transferasa.

14. Vector, según la reivindicación 12 ó la reivindicación 13, en el que dicho antígeno específico es un antígeno de HPV seleccionado del grupo que comprende E5, E6, E7; L1 y L2, ya sea de forma individual o en combinación.

15. Vector, según la reivindicación 14, en el que dicho antígeno de HPV es una forma anclada a membrana de una variante no oncogénica del antígeno temprano E6 y/o E7 de HPV-16.

16. Partícula viral infecciosa que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7

o un vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15.

17. Proceso para la producción de una partícula viral infecciosa según la reivindicación 16, que comprende las etapas de:

(a) introducir el vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 en una línea celular adecuada,

(b) cultivar dicha línea celular en condiciones adecuadas para permitir la producción de dicha partícula viral infecciosa, y

(c) recuperar la partícula viral infecciosa producida del cultivo de dicha línea celular, y

(d) de manera opcional, purificar dicha partícula viral infecciosa recuperada.

18. Célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7 o el vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 o la partícula viral infecciosa según la reivindicación 16.

19. Método para la producción de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende introducir un vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 o una partícula viral infecciosa según la reivindicación 16 en una célula huésped adecuada para producir una célula huésped transfectada o infectada, cultivar in vitro dicha célula huésped transfectada o infectada en condiciones adecuadas para el crecimiento de la célula huésped, y, a continuación, recuperar dicha proteína de fusión de dicho cultivo y, de manera opcional, purificar dicha proteína de fusión recuperada.

20. Composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, la partícula viral infecciosa según la reivindicación 16, la célula huésped según la reivindicación 18 o cualquier combinación de los mismos, y, de manera opcional, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Utilización de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, la partícula viral infecciosa según la reivindicación 16, la célula huésped según la reivindicación 18 o la composición según la reivindicación 20, para la preparación de un fármaco destinado al tratamiento o la prevención de un cáncer o una enfermedad infecciosa.

22. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, partícula viral infecciosa según la reivindicación 16, célula huésped según la reivindicación 18 o composición según la reivindicación 20, para la utilización en el tratamiento o la prevención de un cáncer o una enfermedad infecciosa.

23. Utilización, según la reivindicación 21, o proteína de fusión, vector, partícula viral infecciosa, célula huésped o composición, según la reivindicación 22, en la que dicho fármaco, proteína de fusión, vector, partícula viral infecciosa, célula huésped o composición se administran en un tumor sólido o próximo al mismo.

24. Utilización, según la reivindicación 21 o la reivindicación 23, o proteína de fusión, vector, partícula viral infecciosa, célula huésped o composición, según la reivindicación 22, en la que dicho fármaco, proteína de fusión, vector, partícula viral infecciosa, célula huésped o composición se administran en combinación con uno o más transgenes o productos de transgenes.

25. Utilización de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, la partícula viral infecciosa según la reivindicación 16, la célula huésped según la reivindicación 18 o la composición según la reivindicación 20, para la preparación de un fármaco para aumentar una respuesta inmune.

26. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, partícula viral infecciosa según la reivindicación 16, célula huésped según la reivindicación 18 o composición según la reivindicación 20, para utilizar en el aumento de una respuesta inmune.

27. Utilización de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, la partícula viral infecciosa según la reivindicación 16, la célula huésped según la reivindicación 18 o la composición según la reivindicación 20, para la preparación de un fármaco destinado al objetivo de activar la maduración de células dendríticas en un organismo animal o humano.

28. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, partícula viral infecciosa según la reivindicación 16, célula huésped según la reivindicación 18 o composición según la reivindicación 20, para utilizar en la activación de la maduración de células dendríticas en un organismo animal o humano.

29. Utilización de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, la partícula viral infecciosa según la reivindicación 16, la célula huésped según la reivindicación 18 o la composición según la reivindicación 20, para la preparación de un fármaco destinado al objetivo de activar células NKT en un organismo animal o humano.

30. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, partícula viral infecciosa según la reivindicación 16, célula huésped según la reivindicación 18 o composición según la reivindicación 20, para utilizar en la activación de células NKT en un organismo animal o humano.

31. Utilización de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, la partícula viral infecciosa según la reivindicación 16, la célula huésped según la reivindicación 18 o la composición según la reivindicación 20, para la preparación de un fármaco que proporciona una citotoxicidad menor tras la administración en un organismo animal o humano en comparación con la citotoxicidad observada tras la administración de los grupos X y/o Y al paciente.

32. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, partícula viral infecciosa según la reivindicación 16, célula huésped según la reivindicación 18 o composición según la reivindicación 20, para proporcionar una citotoxicidad menor tras la administración en un organismo animal o humano en comparación con la citotoxicidad observada tras la administración de los grupos X y/o Y al paciente.