Una cepa de Bacillus pumilus capaz de producir tetrametilpirazina con alto rendimiento,

que se denomina Bacillus pumilus RX3-17 y que ha sido depositada en el China Center for Type Culture Collection el día 19 de abril de 2006 con el número de depósito CCTCC M 206043, teniendo dicha cepa las siguientes características bacte- rianas: - bacteria en forma de bacilo con una longitud de 1,5 - 3,0 µm, y un diámetro de 0,6 - 0,7 µm; - el color de las colonias es blanco lechoso; - con capacidad de esporulación; - reacción VP positiva; - produce ácido cuando se cultiva con glucosa, arabinosa, xilosa, manitol o fructosa; - capaz de hidrolizar caseína, gelatina y Tween 80; - capaz de utilizar citrato como fuente de carbono; - capaz de vivir en solución de NaCI al 10% (p/p) y crecer bajo 50ºC y - tener una secuencia de rDNA que comparte una similitud del 99% con otras cepas de Bacillus pumilus

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención pertenece al campo de la biotecnología. Hablando concreta-mente, esta invención se refiere a una cepa recientemente aislada de Bacillus pumilus productora de tetrametilpirazina con alto rendimiento. 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La tetrametilpirazina se aisló originalmente de Ligusticum wallichii en 1957. La tetrametilpirazina, cuya tonalidad podría ser descrita como la del cacao, café, lactosa, vino, y la planta de la especie galbanum, se usa ampliamente como aditivo aromati-zante en las industrias alimentaria, tabaquera y alcoholera. Es el principal alcaloide 10 biológicamente activo existente en la yerba china Chuanxiong que mejora la circula-ción de la sangre, tonifica y elimina los coágulos sanguíneos y se usa habitualmente en China como medicamento para diversas enfermedades, tales como enfermedades venosas del corazón y el cerebro, enfermedades del sistema respiratorio y en la en-fermedad glomerular. 15

Hay tres métodos para la producción de tetrametilpirazina, a saber, el método biosintético, la extracción directa de plantas y el método químico de síntesis.

En cuanto a la biosíntesis de tetrametilpirazina, la aplicación de biotecnología se refiere principalmente a la tecnología microbiana que incluye cribado y mutación de cepas y la tecnología de fermentación. Hasta la fecha hay algunos informes proceden-20 tes de China y principalmente de Francia, Japón, Alemania y Estados Unidos.

La tetrametilpirazina puede ser fermentada a partir de algunas clases de azú-cares. Es estado actual de la investigación de la biosíntesis de tetrametilpirazina es como sigue.

Kosuge et al., identificaron primeramente que algunos microbios son capaces 25 de producir pirazinas y en 1962 encontraron que el Bacillus subtilis era un productor de tetrametilpirazina. Ahora se sabe que algunas bacterias y epifitos pueden sintetizar diferentes clases de alquil-pirazinas (Seitz, 1994; Gallois, 1984). Yamaguchi et al., intentaron una vez utilizar estos microorganismos en fermentación sumergida, pero fracasó en su industrialización debido a la baja concentración del producto en el caldo 30 de fermentación (1993).

Itohiki-natto es uno de los alimentos obtenidos por fermentación más popula-res debido a su aroma especial de pirazinas. Es fermentado por los japoneses a partir de Bacillus natto en un medio sólido de semillas de soja. Sin embargo, los resultados fueron deficientes porque las fermentaciones en estado sólido fueron solo experienci-35

les. El rendimiento en sustancias aromatizantes fue menor de 22 µg/kg de peso húme-do (Kosuge et al., 1971).

Besson et al., de Francia realizaron una gran trabajo en este campo. Obtuvie-ron 0,58 g/kg utilizando Bacillus subtilis IFO 3013 por fermentación en estado sólido en medio de semilla de soja (1998). Este fue el mejor resultado del que se informó de 5 métodos biosintéticos para obtener tetrametilpirazina. Pero todavía se requieren gran-des esfuerzos antes de la consecución de la industrialización.

Debido a la baja concentración de tetrametilpirazina en plantas, la extracción de tetrametilpirazina de materiales vegetales es una tecnología costosa y no apta para industrialización. Aunque el método de síntesis química puede producir un alto rendi-10 miento de tetrametilpirazina, exige unas condiciones de reacción intensas y unos equi-pos más sofisticados. Además, la tetrametilpirazina resultante no es considerada un producto natural y hay serios problemas en cuanto a la protección del medio ambiente. En contraste, el método de biosíntesis tiene ventajas tales como producto natural, ba-jos costes de materiales, condiciones de reacción suaves, benignidad ambiental y con 15 vistas al futuro los estudios hacen prever buenas perspectivas a la síntesis de tetrame-tilpirazina. Sin embargo, el aislamiento de la naturaleza de cepas productoras de te-trametilpirazina es un trabajo difícil y los rendimientos de las cepas naturales obtenidas de este modo son usualmente bajos. Al igual que la defectuosa base de partida de otros métodos microbianos, las tecnologías de producción de tetrametilpirazina por 20 biosíntesis por ahora son inmaduras y no han sido industrializadas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Debido a las dificultades y problemas actuales implicados en la producción de tetrametilpirazina, el objetivo de esta invención es aportar un Bacillus pumilus de alto rendimiento recientemente aislado para producir tetrametilpirazina con el sustrato de 25 glucosa, que puede ser empleado para la fermentación de tetrametilpirazina.

La cepa Bacillus pumilus RX3-17 de esta invención ha sido depositada en el China Center for Type Culture Collection el 19 de abril de 2006. El número de depósito es CCTCC M 206043.

Las características fisiológicas y bioquímicas de Bacillus pumilus RX3-17 30 CCTCC M 206043 se describen en la Tabla 1 siguiente.

Tabla 1. Características fisiológicas y bioquímicas de la cepa Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043

Características

Resultados

Bacilos

Anchura

Longitud

Esporas

Elipsoides

Esporangios

Reacción VP

pH en VP

Ácido procedente de glucosa

Ácido procedente de arabinosa

Ácido procedente de xilosa

Ácido procedente de manitol

Ácido procedente de fructosa

Gas procedente de glucosa

Hidrólisis de caseína

Hidrólisis de gelatina

Hidrólisis de almidón

Hidrólisis de Tween 80

Hidrólisis de esculina

Utilización de citrato

Utilización de propionato

Degradación de tirosina

Fenilalanina-desaminasa

NO3 a NO2

Indol

Crecimiento a pH 5,7

Crecimiento con NaCl al 2%

Crecimiento con NaCl al 5%

Crecimiento con NaCl al 7%

Crecimiento con NaCl al 10%

Crecimiento a 45ºC

Crecimiento a 50ºC

Crecimiento a 55ºC

Crecimiento con lisozima al 0,001 %

Arginina-dihidrolasa

+

0,6 – 0,7 µm

1,5 – 3,0 µm

+

+

-

+

5,0

+

+

+

+

+

-

+

+

-

+

-

+

-

-

-

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-

+

+

+

+

+

+

+

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+

-

La secuencia del rDNA de 16S de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 es similar en 99% a las otras cepas de Bacillus pumilus.

La cepa antes mencionada de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 se 5 emplea en la producción de tetrametilpirazina con el medio de fermentación SV que contiene (por litro de agua destilada) 160 ~ 220 g de glucosa, 50 g de peptona de soja, 30 g de (NH4)2HPO4 y 15 mL de solución de mezcla de vitaminas. La solución de mez-cla de vitaminas contiene (por litro de agua destilada) 1,0 mg de d-biotina, 1,0 mg de

tiamina-HCl, 5,0 mg de riboflavina, 25 mg de piridoxina-HCl, 50 mg de ácido p-aminobenzoico, 100 mg de pantotenato-1/2 Ca y 100 mg de ácido nicotínico.

Cuando se usa el Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 antes mencio-nado para producir tetrametilpirazina con el medio de fermentación SV, la temperatura de fermentación es 37ºC y la cepa se inocula en 50 mL del medio de fermentación SV 5 en matraces cónicos de 500 ml que se mantienen en un agitador a 120 rpm durante 96 ~ 120 horas para obtener el caldo de fermentación de tetrametilpirazina maduro.

La presente invención supera...

1. Una cepa de Bacillus pumilus capaz de producir tetrametilpirazina con alto rendimiento, que se denomina Bacillus pumilus RX3-17 y que ha sido depositada en el China Center for Type Culture Collection el día 19 de abril de 2006 con el número de depósito CCTCC M 206043, teniendo dicha cepa las siguientes características bacte-5 rianas:

- bacteria en forma de bacilo con una longitud de 1,5 – 3,0 µm, y un diámetro de 0,6 – 0,7 µm;

- el color de las colonias es blanco lechoso;

- con capacidad de esporulación; 10

- reacción VP positiva;

- produce ácido cuando se cultiva con glucosa, arabinosa, xilosa, manitol o fructosa;

- capaz de hidrolizar caseína, gelatina y Tween 80;

- capaz de utilizar citrato como fuente de carbono; 15

- capaz de vivir en solución de NaCI al 10% (p/p) y crecer bajo 50ºC y

- tener una secuencia de rDNA que comparte una similitud del 99% con otras cepas de Bacillus pumilus.

2. La característica de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 de acuer-do con la reivindicación 1, en donde esta cepa se aplica a la fermentación de tetrame-20 tilpirazina.

3. La característica de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 de acuer-do con la reivindicación 2, en donde esta cepa se usa para producir tetrametilpirazina con el medio de fermentación SV.

4. La característica de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 de acuer-25 do con la reivindicación 3, en donde el medio de fermentación contiene (por litro de agua destilada) 160 ~ 220 g de glucosa, 50 g de peptona de soja, 30 g de (NH4)2HPO4 y 15 ml de solución de mezcla de vitaminas.

5. La característica de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 de acuer-do con la reivindicación 4, en donde la solución de mezcla de vitaminas contiene (por 30 litro de agua destilada) 1,0 mg de d-biotina, 1,0 mg de tiamina-HCl, 5,0 mg de ribofla-vina, 25 mg de piridoxina-HCl, 50 mg de ácido p-aminobenzoico, 100 mg de pantote-nato-1/2 Ca y 100 mg de ácido nicotínico.

6. La característica de Bacillus pumilus RX3-17 CCTCC M 206043 de acuer-do con la reivindicación 2 ó 3, en donde esta cepa se inocula en 50 ml del medio de 35

fermentación SV en matraces cónicos de 500 mL que se mantienen en un agitador a 120 rpm y 37ºC durante 96 ~ 120 horas para obtener el caldo de fermentación de te-trametilpirazina maduro.