Un oligonucleótido específico de Mycobacterium kansasii para la detección de Mycobacterium kansasii que comprende una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm.

1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar y/o identificar M. kansasii (Mycobacterium kansasii, en adelante descrita M. kansasii) a través del uso de amplificación de ácido nucleico y un sistema de detección del mismo en un ensayo clínico de laboratorio.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Mycobacterium no tuberculosa (NTM) es un bacilo gram positivo que tiene características de ácido-alcohol resistentes clasificado en el género Mycobacterium, y es un tipo de bacteria ácido-alcohol resistente distinta al complejo de tuberculosis y Mycobacterium leprae.

Entre la mycobacterium no tuberculosa, es sabido que la cepa bacteriana clínicamente problemática incluye Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium szulgai, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chelonei, Mycobacterium abscessus, y etc. En particular, las enfermedades infecciosas afectadas por 2 tipos de bacterias, M. kansasii y complejo M. avium, representan el 90% o más de la totalidad de las enfermedades por mycobacterium no tuberculoso.

En general, se sostiene que la mycobacterium no tuberculosa es inofensiva para un individuo saludable, sin embargo, en ocasiones poco frecuentes, puede infectar a seres humanos y causar enfermedades por mycobacterium no tuberculosa. Particularmente, en los individuos inmunocomprometidos tales como pacientes infectados con el virus del SIDA puede ser un agente causativo de infecciones serias. En el pasado, las enfermedades por mycobacterium no tuberculosa han sido un trastorno poco frecuente, sin embargo, en los últimos años, la incidencia de infección demuestra una tendencia en alza, y, por lo tanto, se ha deseado ampliamente el desarrollo de un procedimiento para discriminar bacterias tuberculosas de mycobacterium no tuberculosa en un período de tiempo breve. Además, dado que el procedimiento para detectar/diagnosticar M. avium y M. intracellulare por amplificación de ácido nucleico ha sido aprobado para su inclusión en la cobertura del seguro médico y después se ha propagado rápidamente por el país, su significancia diagnóstica es, por supuesto, muy grande.

Dado que la mayoría de las mycobacteria no tuberculosas tienen una resistencia a agentes antituberculosos, cuando se sospecha que un paciente tiene una infección por una bacteria ácido-alcohol resistente, la diferencia en el diagnóstico referente a si la enfermedad es una enfermedad por mycobacterium tuberculosa o no tuberculosa será muy importante a la hora de decidir el curso del tratamiento. Además, ya que el procedimiento para el tratamiento de las enfermedades causadas por mycobacteria no tuberculosas puede variar para cada tipo de bacteria, la identificación de las especies bacterianas también será muy importante. Sin embargo, dado que la enfermedad por mycobacterium no tuberculosa no tiene un síntoma clínico específico, es muy difícil diferenciar la enfermedad por mycobacterium tuberculosa de la enfermedad por mycobacterium no tuberculosa por observación clínica y manifestación histopatológica, más aún lo es especificar las especies de la mycobacterium no tuberculosa. Por lo tanto, el diagnóstico referente a si la enfermedad es una enfermedad por mycobacterium tuberculosa o no tuberculosa debe llevarse a cabo por la identificación de la bacteria infectada.

En un diagnóstico típico, en primer lugar, se examina el frotis del esputo. Mediante este ensayo, puede reconocerse únicamente “la bacteria ácido-alcohol resistente positiva", y no puede lograrse la diferenciación de la bacteria tuberculosa de la mycobacterium no tuberculosa. Por lo tanto, cuando el examen del frotis del esputo es positivo, se lleva cabo un examen de un cultivo bacteriano por cultivo en aislamiento sobre un medio de cultivo especificado tal como medio de Ogawa para diferenciar la bacteria tuberculosa de la mycobacterium no tuberculosa. Además, a través de exámenes químicos adicionales, se identifica la especie de la bacteria. Sin embargo, en general, el crecimiento de la bacteria perteneciente al género Mycobacterium es lento, y su cultivo lleva un tiempo considerable. Por consiguiente, en los procedimientos básicos del procedimiento convencional que incluye examen del esputo y examen del cultivo, el resultado del diagnóstico por parte del cultivo en aislamiento que informa si la bacteria es tuberculosa o no, demora de 3 a 4 semanas. Además, existe otro problema, dado que requiere de 2 a 3 semanas adicionales para completar varios ensayos bioquímicos para la identificación de especies bacterianas.

Además, la identificación de M. kansasii también se lleva a cabo por ensayos bioquímicos. En el procedimiento principal para identificar M. kansasii por ensayos bioquímicos, se utiliza la propiedad específica para producir pigmentos cuando la bacteria se expone a la luz. Sin embargo, dado que otras especies pertenecientes al género Mycobacterium muestran las mismas propiedades que M. kansasii, la identificación de M. kansasii por su propiedad de coloración es en general problemática.

En los años recientes, se han desarrollado tecnologías para detectar bacterias a un nivel genético. Por ejemplo, se ha estudiado como un medio útil una técnica de diagnóstico que utiliza tecnología de amplificación de ácido nucleico tal como reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Este procedimiento tiene ventajas de alta sensibilidad; varias células de las bacterias son suficientes para la detección; la detección puede completarse en un período de tiempo breve (de 4 días como máximo). Sin embargo, en el procedimiento de PCR usual, se detectan por igual tanto células vivas como células muertas. Además, dado que el procedimiento se juzga positivo independientemente del tamaño del recuento de bacterias, y que el número de las bacterias es desconocido, el diagnóstico de si la infección es positiva o no se proporcionará con incertidumbre. Además, el procedimiento tiene un problema, dado que cuenta con una sensibilidad demasiado alta, existe la posibilidad de falsos juicios positivos.

Respecto a M. kansasii, existe un estudio que informa que se obtuvo una sonda de ADN (pMKI-9) a partir de una librería genómica de M. kansasii (Documento de No Patente 1). Esta sonda de ADN (pMK1-9) puede formar un híbrido complementario con el ADN de M. kansasii, pero esta sonda también puede formar un híbrido con otras especies de mycobacteria, y no es específica a M. kansasii.

Asimismo, existe un estudio focalizado en el uso de una sonda de ADN comercialmente disponible (ACCUPROBE™, GenProbe, San Diego, CA) que puede hibridizarse específicamente con la sonda pMK1-9 y el gen de ARNr de M. kansasii para la identificación de M. kansasii (Documento de No Patente 2). Sin embargo, en este estudio, se ha informado que tanto la sonda pMK1-9 como la sonda de ADN comercialmente disponible (ACCU-PROBE™) fueron incapaces de detectar un número considerable de tipos de cepa de M. kartsasii.

Además, existe otro estudio en el que se evaluó la sonda de ADN comercialmente disponible (ACCUPROBE™) para la detección de M. kansasii (Documento de No Patente 3). Los investigadores de este estudio informaron que si bien ACCU-PROBE™ es 100% especie específico, y no muestra ninguna reacción cruzada con otras especies de M. kansasii, sólo podría detectarse en este experimento un 73% de las especies de M. kansasii.

Existe un informe que describe que una sonda de formación de ADN híbrido (p6123) específica a M. kansasii se ha purificado con un aislado clínico de M. kansasii (Documento de No Patente 4). La sonda (p6123) fue capaz de hibridizarse con todas las cepas de M. kansasii utilizadas en este experimento que incluyen un subgrupo que no reaccionó con una sonda de ADN (pMK1-9) informado por Ross et al. La Patente de los Estados Unidos Núm.

5.500.341 (Documento de Patente 2) ha desvelado un cebador de amplificación específico de M. kansasii purificado con una sonda p6123.

Además, B. Boddinghaus et al. han desvelado un oligonucleótido específico de Mycobacterium purificado con ARNr 16S, que específica se prolifera e hibridiza con ADN de mycobacterium (Documento de No Patente 5).

Además, por ejemplo, también se ha estudiado la identificación de la región del ADN efectiva para detectar M. kansasii (por ejemplo, Documento de Patente 1), sin embargo, la presente situación indica no se ha establecido el procedimiento de diagnóstico específico de M. kansasii.... [Seguir leyendo]

1. Un oligonucleótido específico de Mycobacterium kansasii para la detección de Mycobacterium kansasii que comprende una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos.

2. Un cebador para detectar Mycobacterium kansasii, que comprende un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, en la que el oligonucleótido es una parte de un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 1, o

un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos seleccionada a partir de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, en la que el oligonucleótido es una parte de un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 1, y en la que el oligonucleótido es capaz de hibridizarse con una secuencia de nucleótidos del gen de Mycobacterium kansasii.

3. El cebador de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el cebador está marcado con una secuencia marcadora.

4. El cebador de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la sustancia marcadora se selecciona de un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente o biotina.

5. Una sonda para detectar Mycobacterium kansasii, que comprende un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, 53 a 56 y 80, en la que el oligonucleótido es una parte de un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm.1, o

un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos seleccionada a partir de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, 53 a 56 y 80, en la que el oligonucleótido es una parte de un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 1, y en el que el oligonucleótido es capaz de hibridizarse con una secuencia de nucleótidos del gen de Mycobacterium kansasii.

6. La sonda de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la sonda está marcada con una sustancia marcadora.

7. La sonda de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la sustancia marcadora se selecciona de un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente o biotina.

8. La sonda de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el extremo terminal 5' está marcado con un tinte fluorescente reportero y el extremo terminal 3' está marcado con un tinte desactivante.

9. Un procedimiento para detectar Mycobacterium kansasii que comprende utilizar un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, en la que el oligonucleótido es una parte de un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 1, o

un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, en la que el oligonucleótido es una parte de un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm.1, y

en la que el oligonucleótido es capaz de hibridizarse con una secuencia de nucleótidos de Mycobacterium kansasii, como un cebador, y/o un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, 53 a 56 y 80, en la que el oligonucleótido es una parte de un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm.1, o

un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, 53 a 56 y 80, en el que el oligonucleótido es una parte de un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm.1, y

en la que el oligonucleótido es capaz de hibridizarse con una secuencia de nucleótidos de Mycobacterium kansasii, como una sonda.

10. El procedimiento de detección de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende;

llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico con el uso como un cebador de un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, en la que el oligonucleótido es capaz de hibridizarse con una secuencia de nucleótidos del gen de Mycobacterium kansasii; y

utilizar un ácido nucleico en una muestra como una plantilla; y

detectar un producto de extensión del cebador.

11. El procedimiento de detección de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el procedimiento comprende los siguientes procedimientos:

(1) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico con el uso como un cebador de un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, en la que el oligonucleótido es capaz de hibridizarse con una secuencia de nucleótidos del gen de Mycobacterium kansasii, y utilizar un ácido nucleico en una muestra como una plantilla; y

(2) llevar a cabo electroforesis del producto de extensión del cebador obtenido en el apartado anterior (1), y detectar Mycobacterium kansasii sobre la base del resultado obtenido.

12. El procedimiento de detección de acuerdo con la reivindicación 11, que además comprende después de llevar a cabo electroforesis, confirmar una fracción del producto de extensión del cebador que tenga el número objetivo de pares de base en la fracción electroforética obtenida, en la que el número objetivo de pares de base sea el número de pares de base del producto de extensión del cebador, que se espera sea replicado por PCR por el uso del cebador directo y el cebador inverso.

13. El procedimiento de detección de acuerdo con la reivindicación 11, que además comprende, después de la electroforesis, hibridizar la fracción electroforética obtenida con una sonda marcada preparada por el marcado de un oligonucleótido con una sustancia marcadora, en la que el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, 53 a 56 y 80, o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, 53 a 56 y 80, y es capaz de hibridizarse con la secuencia de nucleótidos del gen de Mycobacterium kansasii;

detectar una señal derivada de la sonda marcada, y

determinar la muestra que está confirmada que tiene una fracción hibridizada con la sonda marcada mencionada con anterioridad, que es positiva.

14. El procedimiento de detección de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la sustancia marcadora se selecciona de un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente y biotina.

15. El procedimiento para detectar Mycobacterium kansasii de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el cebador está marcado con una secuencia marcadora; y

el procedimiento incluye un procedimiento para llevar a cabo una reacción en cadena de polimerasa por el uso de un cebador marcado y un ácido nucleico en una muestra como una plantilla, y medir una señal derivada del producto de extensión del cebador obtenido.

16. El procedimiento de detección de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la sustancia marcadora se selecciona de un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente y biotina.

17. El procedimiento de detección de acuerdo con la reivindicación 15, que además comprende después de llevar a cabo la reacción en cadena de polimerasa, eliminar un cebador marcado libre, y medir la señal derivada del producto de extensión del cebador.

18. El procedimiento de detección de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el cebador marcado libre se elimina por la eliminación de un sobrenadante después de la precipitación del producto de extensión del cebador en el producto de reacción que se obtiene llevando a cabo una reacción en cadena de la polimerasa.

19. El procedimiento de detección de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el cebador marcado libre se elimina por el tratamiento del producto de reacción, que se obtiene llevando a cabo una reacción en cadena de la polimerasa, con cromatografía en gel.

20. El procedimiento para detectar Mycobacterium kansasii de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende;

hibridizar una sonda marcada preparada por la marcación del oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, 53 a 56 y 80, o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, 53 a 56 y 80, en la que el oligonucleótido es capaz de hibridizarse con la secuencia de nucleótidos del gen de Mycobacterium kansasii con una sustancia marcadora,

eliminar una sonda marcada libre, y

detectar una señal derivada de un complejo hibridizado.

21. El procedimiento de detección de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la sustancia marcadora se selecciona de un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente y biotina.

22. Un kit para detectar Mycobacterium kansasii, que comprende un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12 como un cebador, y/o un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, 53 a 56 y 80, o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos seleccionada de la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 5 a 12, 53 a 56 y 80 como una sonda, en la que el oligonucleótido es capaz de hibridizarse con la secuencia de nucleótidos del gen de Mycobacterium kansasii gene, como un cebador y/o una sonda.

23. El kit de acuerdo con la reivindicación 22, en el que el cebador y/o la sonda están marcados con una sustancia marcadora.

24. El kit de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la sustancia marcadora se selecciona de un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente y biotina.

25. El kit de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la sonda es aquella en la que el extremo terminal 5' está marcado con un tinte fluorescente reportero y el extremo terminal 3' está marcado con un tinte inactivador.

26. Uso de un oligonucleótido para diseñar un cebador o una sonda para la detección de Mycobacterium kansasii, en el que el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID Núm. 1, o una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos, y que es capaz de hibridizarse con la secuencia de nucleótidos del gen de Mycobacterium kansasii.