CASSETTE DE EXPRESIÓN DE PROMOTOR MÚLTIPLE PARA EL SUMINISTRO SIMULTÁNEO DE AGENTES ARNi.

Cassette de expresión de promotor múltiple para el suministro simultáneo de agentes ARNi ANTECENDENTES DE LA INVENCIÓN La utilización de ARN de doble cadena para inhibir la expresión de genes de manera específica de una secuencia ha revolucionado la industria de descubrimiento de medicamentos. En los mamíferos, la interferencia de ARN o ARNi, está mediada por moléculas de ARN con una longitud de 19 a 29 nucleótidos, de doble cadena, a las que se hace referencia como ARN de interferencia pequeña, que son derivadas por fraccionamiento enzimático de ARN largo, de doble cadena, dentro de células in vivo. Los agentes ARNi pueden ser sintetizados químicamente o enzimáticamente fuera de células, y pueden ser suministrados a continuación a células (ver, por ejemplo Fire, y otros, Nature, 391:806-11 (1998); Tuschl, y otros, Genes, y Dev, 13: 3191-97 (1999); y Elbashir, y otros, Nature, 411:494-498 (2001)); o se pueden expresar in vivo por un vector apropiado en células (ver, por ejemplo, McCaffrey, y otros, Nature Biotech. 21 (6): 639-644 (2003)). No obstante, el suministro in vivo de ARNi sin modificar, como terapéutica efectiva para su utilización en humanos, se enfrenta a una serie de dificultades técnicas. En primer lugar, debido a nucleasas celulares y del suero, la media vida del ARN inyectado in vivo es solamente de unos 70 segundos (ver, por ejemplo, Kurreck, Eur. J. Bioch. 270:1628-44 (2003)). Se han hecho esfuerzos para incrementar la estabilidad del ARN inyectado mediante la utilización de modificaciones químicas; no obstante, hay varios casos en los que las alteraciones químicas han conducido a efectos citotóxicos mayores. En un ejemplo específico, las células eran intolerantes a dosis de un ARNi duplex, en el que cada segundo fosfato estaba sustituido por fosforotioato (Harboth, y otros, Antisense Nucleic Acid Drug Rev. 13(2): 83-105 (2003)). Otros problemas comprenden el suministro específico de tejidos, así como la posibilidad de suministrar los agentes ARNi en cantidades suficientes para elicitar una respuesta terapéutica, pero que no sean tóxicos. Varias opciones están siendo exploradas para el suministro de ARNi, incluyendo la utilización de sistemas de vectores basados en virus que pueden infectar células diana y suministrar y expresar moléculas de ARNi in situ. De manera típica, ARN de pequeñas dimensiones, aproximadamente 70 nucleótidos, son transcritos como precursores cortos de horquilla (ARNsh) desde un núcleo de vector vírico. Una vez transcritos, los ARNsh son procesados por la enzima Dicer en especies activas de ARNi apropiadas. Los sistemas de suministro basados en virus intentan explotar las propiedades de direccionado de virus para generar especificidad para tejidos, y una vez han sido apropiadamente direccionados, se basan en una mecánica celular endógena para generar suficientes niveles de especies de ARNi para conseguir una dosis terapéuticamente efectiva. En la actualidad, los virus más habitualmente utilizados para el suministro de secuencias diana son los que se basan en sistemas evolucionados de retrovirus, virus de herpes simplex (HSV, o adenovirus (Ad)). Todos estos vectores pueden recibir insertos grandes y pueden ser producidos con titulaciones terapéuticamente relevantes. No obstante, en todos los sistemas hay preocupaciones con respecto al desarrollo de cáncer (Cavazzana-Calvo, y otros, Science, 288:669-72 (2000)), así como respuestas inmunes del huésped poco deseables, y toxicidad resultante en los pacientes. Otro virus que es útil para el suministro de ARNi es el virus adeno-asociado (AAV). Una aplicación útil de la terapéutica de ARNi es un agente antivírico. En general, los virus ARN dependen de ARN polimerasa dependiente de ARN/ADN para replicación. Dichas polimerasas ARN/ADN replican el genoma vírico con una fidelidad comparativamente baja, cuya consecuencia funcional produce genomas con un número excepcionalmente elevado de mutaciones. Esto resulta en la capacidad de evolución rápida de viriones de progenie para evadirse de los agentes habituales inmunológicos y químicos antivíricos. Por esta razón, de manera similar a los efectos observados con terapéutica de moléculas pequeñas, la potencia y eficacia relativas de la terapéutica de ARNi puede disminuir como resultado de la evolución vírica durante tratamiento a largo plazo. En un estudio, aparecieron mutantes de escape de VIH, que contenían un único cambio de nucleótido 35 días después del suministro de un ARNsh expresado (Boden, y otros, J. Virol 77(21): 11531-11535 (2003)). En otro estudio, se pudieron detectar mutantes de escape poliovirus en un periodo corto de 54 horas después de la infección en células que habían sido transfectadas con ARNi presintetizado. No obstante, el suministro sumultáneo de dos ARNi contra secuencias diana múltiples dentro del virus retrasaron significativamente el inicio de las variantes de escape (ver Gitlin, y otros, Nature. 418:430-434 (2002)). Por lo tanto, existe en la técnica la necesidad de desarrollar terapéuticas de ARNi, efectivas y estables. La presente invención satisface esta necesidad del sector. RESUMEN DE LA INVENCIÓN ES 2 366 126 T3 La presente invención está dirigida a composiciones innovadoras y a su utilización en el suministro de especies o agentes de ARNi a células diana. Las especies ARNi forman parte de un constructo de expresión de un promotor múltiple, suministrado preferentemente mediante un sistema de suministro vírico. Dado que se utilizan tres o más 2 agentes ARNi por constructo, la presente invención es particularmente útil en el direccionado de organismos con genes diana, que tienen diferencias de secuencia (SNPs) entre variantes, de manera que cada uno de los agentes de ARNi introducidos puede ser dirigido a uno o varios subconjuntos de variantes. De manera similar, las composiciones y utilizaciones de la presente invención son también útiles en el tratamiento de estados de enfermedad provocados por patógenos rápidamente mutantes, tales como enfermedades provocadas por agentes víricos basados en ARN; es decir, es menos probable que los mutantes de escape vírico sean capaces de evitar el efecto de tres o más secuencias distintas de ARNi. Por esta razón, las realizaciones de la presente invención facilitan un cassette de expresión de promotor múltiple, que comprende: como mínimo, tres componentes promotor/ARNi/finalizador, en el que cada componente promotor/ARNi/finalizador comprende un elemento promotor, un elemento finalizador, y una secuencia que codifica una especie de ARNi enlazada de manera operativa al elemento promotor y al elemento finalizador, de manera que la especie ARNi se dirige a una secuencia de ácido nucleico transcrita, y, como mínimo, una de las especies de ARNi es codificada por SEQ ID Nº: 22. Preferentemente, en el caso de que la secuencia de cada una de las especies de ARNi son distintas entre sí. En varios aspectos preferentes de esta realización, la secuencia de cada uno de los elementos promotores del cassette de expresión de promotor múltiple son diferentes entre sí. En otros aspectos de esta realización, la secuencia de cada uno de los elementos de finalización en el cassette de expresión de promotor múltiple son distintas entre sí y/o cada elemento de finalización es tomado del mismo gen que el elemento promotor con el que está apareado en la naturaleza. Además, en un aspecto de esta realización, la presente invención da a conocer un constructo de expresión de promotor múltiple que contiene elementos necesarios para el empaquetado del vector terapéutico en partículas de virus infeccioso. En otra realización de la presente invención, el constructo genético antes descrito está destinado a su utilización en la inhibición de una o varias secuencias de ácido nucleico transcritas a partir de virus de hepatitis C, o para utilización en la inhibición de una o varias secuencias de ácido nucleico transcritas a partir de virus de hepatitis C, de manera que dicho constructo genético está empaquetado en partículas víricas o no víricas. En aspectos de esta realización de la invención, la secuencia o secuencias transcritas de ácido nucleico son genes necesarios para la infección o mantenimiento de la infección de las células por el virus de hepatitis C. Una realización alternativa de la invención incluye la utilización del constructo genético antes mencionado en la fabricación de un medicamento a utilizar en la inhibición de una o varias secuencias de ácido nucleico transcritas a partir de virus de hepatitis C, o para utilización en la inhibición de una o varias secuencias de ácido nucleico transcritas a partir de virus de hepatitis C, de manera que dicho constructo genético está empaquetado en partículas víricas o no víricas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS ES 2 366 126 T3 A efectos de que el modo... [Seguir leyendo]

1. Constructo genético que comprende un cassette de expresión de promotores múltiples que comprende, como mínimo, tres componentes promotor/ARNi/finalizador, en el que cada componente promotor/ARNi/finalizador comprende un elemento promotor, un elemento finalizador, y una secuencia que codifica una especie de ARNi enlazado operativamente al elemento promotor y al elemento finalizador, de manera que la especie de ARNi usa como diana una secuencia de ácidos nucleicos transcrita y, como mínimo, una de las especies de ARNi es codificada por SEQ ID Nº: 22. 2. Constructo genético, según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico transcrita procede de un genoma del virus (HCB) de Hepatitis C. 3. Constructo genético, según la reivindicación 1 ó 2, en el que el constructo genético comprende además, elementos necesarios para empaquetar el constructo en partículas de virus infeccioso. 4. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia de cada uno de los elementos finalizadores en cada componente promotor/ARNi/finalizador es distinta de las otras. 5. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia de cada uno de los elementos promotores en cada componente promotor/ARNi/finalizador es distinta de las otras. 6. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que cada especie de ARNi usa como diana una diferente región del genoma HCV. 7. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que, como mínimo, una de las tres o más especies de ARNi es codificada por SEQ ID Nºs: 6 ó 19. 8. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las, como mínimo, tres especies de ARNi son codificadas por SEQ ID Nºs:6, 19 y 22. 9. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las tres o más especies de ARNi usan como diana secuencias transcritas de ácido nucleico que tienen diferencias de secuencia entre variantes, y cada una de las especies de ARNi usan como diana uno o varios subconjuntos de variantes. 10. Constructo genético, según la reivindicación 9, en el que dichas diferencias son polimorfismos de nucleótido único (SNP). 11. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 9 a 10, en el que las especies de ARNi usan como diana secuencias víricas que sufren mutación rápida. 12. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 9 a 11, en el que cada una de las especies de ARNi usa como diana una o varias variantes de una secuencia de ácido nucleico transcrita. 13. Constructo genético, según la reivindicación 12, en el que dichas variantes incluyen mutantes de escape vírico. 14. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 9 a 13, en el que las especies de ARNi se basan en la secuencia de la secuencia de ácidos nucleicos transcrita y se basan adicionalmente en secuencias que tienen mutaciones de puntos que resultan resistentes a tratamiento ARNi. 15. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que cada una de las especies de ARNi es, como mínimo, idéntica al 90% con la secuencia de ácidos nucleicos transcrita. 16. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 9 a 14, en el que las especies ARNi son, como mínimo, 90% idénticas a dicha secuencia de ácidos nucleicos transcrita, y a dos o más mutaciones en dicha secuencia de ácidos nucleicos que se muestran como mutantes de escape. 17. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dichas especies de ARNi están expresadas en forma de ARNsh. 18. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para utilización en la inhibición de una o varias secuencias de ácidos nucleicos transcritas de virus de Hepatitis C. 19. Constructo genético, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para utilización en la inhibición de una o varias secuencias de ácidos nucleicos transcritas a partir de virus de Hepatitis C, en el que dicho constructo genético está empaquetado en partículas víricas o no víricas. 37 ES 2 366 126 T3 20. Utilización del constructo genético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la fabricación de un medicamento para utilización, según la reivindicaciones 18 ó 19. 38 ES 2 366 126 T3 39 ES 2 366 126 T3 ES 2 366 126 T3 41 ES 2 366 126 T3 42 ES 2 366 126 T3 43 ES 2 366 126 T3 44 ES 2 366 126 T3 ES 2 366 126 T3 46 ES 2 366 126 T3 47 ES 2 366 126 T3 48 ES 2 366 126 T3 49 ES 2 366 126 T3 ES 2 366 126 T3 51 ES 2 366 126 T3 52 ES 2 366 126 T3 53 ES 2 366 126 T3 54 ES 2 366 126 T3 ES 2 366 126 T3 56 ES 2 366 126 T3 57 ES 2 366 126 T3 58 ES 2 366 126 T3 59 ES 2 366 126 T3 ES 2 366 126 T3 61 ES 2 366 126 T3 62