Una proteína ß-mananasa aislada que presenta una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 90% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se relaciona con una proteína β-mananasa aislada y usos de la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Mananasas son enzimas que hidrolizan mananos y polisacáridos hemicelulósicos relacionados, tales como el galactomanano y el glucogalactomanano (también conocido como galactoglucomanano). Estos polisacáridos son componentes característicos de las paredes celulares de plantas y por ende un importante uso comercial potencial de las mananasas está en la degradación de materiales hemicelulósicos a partir de biomasa vegetal, proporcionando así un medio de recuperación de azúcares solubles a partir de estos biopolímeros. Los polisacáridos de manano también se encuentran como polímeros de almacenamiento en las semillas de algunas especies vegetales tales como aquellas de plantas leguminosas, y árboles coníferos.

En el grano del café, los galactomananos se acumulan en extremadamente altas concentraciones y representan aproximadamente un 24% del peso en seco del grano (Bradbury et al., “Chemical Structures of Green Coffee Bean Polysaccharides”, J. Agric. Food Chem. 38:389-392 (1990)). Estos polisacáridos consisten de una cadena lineal de residuos de manosilo enlazados entre sí por medio de enlaces beta 1,4 glicosilos a los cuales están fijados monómeros de residuos de alfa-galactosilo. Se conoce que las endo-beta-mananasas (EC 3.2.1.78) hidrolizan polímeros de manano durante la germinación de semillas, por lo tanto facilitando la salida de la raíz durante la germinación y así liberando pequeños oligosacáridos los cuales luego son usados como fuente de energía para el crecimiento de la joven planta. Por cierto, se ha demostrado en varias plantas que la actividad de la endo-beta-mananasa está principalmente detectada en el endoesperma de las semillas durante la germinación (Bewley, “Breaking Down the Walls – A Role for Endo-Beta-Mannanase In Release from Seed Dormancy?” Trends Plant Sci. 2:464-469 (1997)).

Las mananasas son producidas por microorganismos como los mohos, levaduras y hongos, como también el Bacillus subtilis, Aeromonas, Enterococcus, Pseudomonas, y Streptomyces. Otras plantas más desarrolladas o inclusive animales pueden producir mananasas; sin embargo, no hay indicio en la literatura que describa una beta-mananasa a partir de insectos. Los microorganismos típicamente usados para la producción comercial de mananasas incluyen la Trichoderma o Aspergillus spp.

En procesos industriales, durante el tratamiento del café, los mananos y sus derivados constituyen una porción considerable de los sedimentos insolubles. Adicionalmente, en el primer paso de extracción durante la producción del café solamente un 50% aproximadamente de los mananos son solubles y estos polímeros por lo tanto son responsables de la mayoría de las precipitaciones secundarias que ocurren durante los pasos subsiguientes. La Patente Europea No. 0676145A demuestra que es posible hidrolizar galactomananos del café usando una mananasa inmovilizada extraída del Aspergillus niger.

La presente invención está relacionada con el intento de solucionar estas y otras limitaciones en el estado de la técnica.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Un aspecto de la presente invención está relacionado con una proteína β-mananasa aislada la cual tiene una secuencia de aminoácidos que es 90% similar a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1. La presente invención también se relaciona con un polinucleótido aislado que codifica la proteína β-mananasa, y un sistema de expresión aislado y una célula hospedadora que contiene el polinucleótido.

Otro aspecto de la presente invención está relacionado con un método de producir de manera recombinante una proteína β-mananasa. Este método implica proporcionar una célula hospedadora que contenga el polinucleótido de la presente invención y cultivar la célula hospedadora bajo condiciones que sean efectivas para que la célula hospedadora exprese la proteína β-mananasa. La proteína β-mananasa es recuperada. Un aspecto adicional de la presente invención está relacionado con un método de degradación de mananos y polisacáridos en material vegetal. Este método comprende proporcionar material vegetal y contactar el material vegetal con la proteína β-mananasa de la presente invención bajo condiciones efectivas para degradar los mananos y polisacáridos en el material vegetal.

La presente invención se relaciona con una secuencia de polinucleótidos aislados la cual codifica una enzima de mananasa involucrada en la hidrólisis de polisacáridos de manano, incluyendo moléculas de manano ramificadas y no ramificadas enlazadas entre sí vía un enlace beta 1,4 glicosilo. El polinucleótido es aislado a partir de un genoma de insecto (broca del café, Hypothenemus hampei).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es una fotografía la cual muestra un análisis SDS-PAGE de la proteína β-mananasa recombinante según una realización de la presente invención expresada en un baculovirus recombinante. Línea 1: marcadores de masa molecular (kDa); Línea 2: proteína concentrada por Speed-vac; Línea 3: mananasa etiquetada con 6x-His purificada usando partículas paramagnéticas.

La Figura 2 es una gráfica que muestra la cronología de la hidrólisis de AZC-galactomanano con β-mananasa recombinante soluble a partir de H. hampei. La actividad enzimática fue determinada mediante el aumento de color azul de la absorbancia a través del tiempo. La actividad de la β-mananasa es un promedio ± SE para tres reacciones.

La Figura 3 es una gráfica que muestra el efecto del pH sobre la actividad de la β-mananasa recombinante del H. hampei, según la presente invención. El tampón era 200 mM acetato de sodio pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 y 11,0.

La Figura 4 es una gráfica que muestra el efecto de la temperatura sobre la actividad de la β-mananasa recombinante del H. hampei. Se incubaron soluciones enzimáticas en tampón de 200 mM acetato de sodio por 120 minutos y las actividades fueron medidas según la descripción en los Ejemplos (infra).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Y REALIZACIONES PREFERIDAS

Un aspecto de la presente invención se relaciona con una proteína β-mananasa aislada a partir de la broca del café (Hypothenemus hampei) con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1, a saber:

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La presente invención también está relacionada con proteínas β-mananasa aisladas que presentan una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% similar, al menos un 91% similar, al menos un 92% similar, al menos un 93% similar, al menos un 94% similar, al menos un 95% similar, al menos un 96% similar, al menos un 97% similar, al menos un 98% similar, y/o al menos un 99% similar a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1.

El polinucleótido que codifica la proteína β-mananasa de la SEQ ID NO: 1 tiene una secuencia de SEQ ID NO:2, a saber:

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Los polinucleótidos aislados que tienen al menos un 90% de similitud, al menos un 91% de similitud, al menos un 92% de similitud, al menos un 93% de similitud, al menos un 94% de similitud, al menos un 95% de similitud, al menos un 5 96% de similitud, al menos un 97% de similitud, al menos un 98% de similitud, y/o al menos un 99% de similitud a la SEQ ID NO:2 también son contemplados por la presente invención.

La secuencia genómica a partir de la cual el polinucleótido aislado de SEQ ID NO:2 es derivado tiene una secuencia de SEQ ID NO:3, a saber:

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La determinación de la identidad porcentual, es decir la similitud de secuencia, entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos puede lograrse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin et al., “Methods for Assessing the Statistical Significance of Molecular Sequence Features by Using General Scoring Schemes”, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:2264-2268 (1990), , modificado como en Karlin... [Seguir leyendo]

1. Una proteína β-mananasa aislada que presenta una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 90% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

2. La proteína β-mananasa aislada de la reivindicación 1, en donde la proteína presenta una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 95% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

3. La proteína β-mananasa aislada de la reivindicación 1, en donde la proteína presenta una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

4. La proteína β-mananasa aislada de la reivindicación 1, en donde la proteína presenta una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

5. Un polinucleótido aislado que codifica la proteína β-mananasa de la reivindicación 1.

6. El polinucleótido aislado de la reivindicación 5, en donde el polinucleótido codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

7. El polinucleótido aislado de la reivindicación 5, en donde el polinucleótido presenta una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.

8. Un sistema de expresión aislado que contiene el polinucleótido de la reivindicación 5.

9. Una célula hospedadora aislada que contiene el polinucleótido de la reivindicación 5.

10. La célula hospedadora de la reivindicación 9, en donde la célula hospedadora es seleccionada a partir del grupo que consiste en células vegetales, células de insectos, células bacterianas, y otras células eucarióticas.

11. Un método de producir de manera recombinante una proteína β-mananasa, comprendiendo dicho método: proporcionar la célula hospedadora de la reivindicación 9; cultivar la célula hospedadora bajo condiciones efectivas para que la célula hospedadora exprese la

proteína β-mananasa; y recuperar la proteína β-mananasa.

12. Un método de degradar mananos y polisacáridos en material vegetal, comprendiendo dicho método: proporcionar material vegetal; y contactar el material vegetal con la proteína β-mananasa de la reivindicación 1 bajo condiciones

efectivas para degradar mananos y polisacáridos en el material vegetal.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el material vegetal son granos de café.

14. El método de la reivindicación 12, que además comprende:

recuperar azúcares solubles a partir del material vegetal degradado, como resultado de contactar la materia vegetal y la proteína β-mananasa.