Una baliza de hibridación que es un oligonucleótido donde (a) el oligonucleótido no posee estructura secundaria que surja de una región del oligonucleótido que se hibride con otra,

(b) el oligonucleótido está formado por residuos nucleotídicos de los cuales más de uno está marcado con un indicador fluorescente en el que la baliza no incluye un extintor asociado y el indicador se selecciona entre el grupo de 6-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína y hexaclorofluoresceína, (c) los residuos nucleotídicos marcados con indicador están posicionados internamente dentro de la secuencia oligonucleotídica, (d) el oligonucleótido es totalmente complementario a un alelo de ADN genómico humano que tiene un polimorfismo conocido en el sitio de unión del oligonucleótido, y (e) la sonda oligonucleotídica está modificada en su extremo 3' como para prevenir la extensión de la cadena durante la amplificación por PCR

Baliza y método de hibridación para detección y discriminación rápida de secuencias.

Introducción

Se ha descrito una multitud de técnicas para detectar secuencias de ADN específicas y marcar polimorfismos de nucleótidos simples conocidos. Varios de estos métodos de detección utilizan la hibridación de sondas marcadas en forma fluorescente y se basan en la transferencia de energía entre los restos dador y aceptor. La presente invención abarca un nuevo y simple sistema de detección con sondas de hibridación fluorescentes que no se basa en la acción enzimática ni en la estructura secundaria de la sonda. La interacción entre estas sondas de hibridación y sus secuencias diana genera alteraciones significativas en la emisión de la fluorescencia. Las variaciones en el potencial de hibridación permiten la discriminación de dianas polimorfas por la cantidad de emisión de fluorescencia y la temperatura de fusión de los dúplex sonda/diana. Los Polimorfismos de un Solo Nucleótido (Single Nucleotide Polymorphisms o SNP) son la forma más abundante de variación de secuencia en el genoma humano y ocurren en promedio cada mil nucleótidos. Un SNP es un sitio dentro de la secuencia de ADN que varía por una única base (sustitución, inserción o deleción) de persona a persona. Estos SNP pueden afectar las características fenotípicas directamente, como determinadas enfermedades, y comúnmente se emplean como marcadores genéticos para identificar rasgos complejos, tales como la respuesta a medicación (Farmacogenética). Los SNP son extremadamente útiles como marcadores genéticos porque evolucionan lentamente y se marcan fácilmente a través de una diversidad de métodos. Se están haciendo intentos a gran escala para descubrir nuevos SNP, para uso en estudios de asociación que pueden permitir la identificación de genes que contribuyen a trastornos genéticos comunes. A su vez, se han desarrollado muchas técnicas para estudiar de manera eficaz los SNP conocidos con un resultado relativamente alto. Los métodos actuales para genotipificación de SNP incluyen análisis por polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (restriction fragment length polymorphism o RFLP) de productos de reacción en cadena de la polimerasa (usando electroforesis en gel para la detección de los fragmentos de restricción), hibridación de oligonucleótidos específicos de alelos (allele-specific oligonucleotide o ASO), sistema de mutación refractaria por amplificación (amplification refractory mutation system o ARMS), ensayo de ligación de oligonucleótidos (oligonucleotide ligation assay u OLA), análisis de polimorfismo de conformación monocatenaria (single-strand conformation polymorphism o SSCP), escisión química, análisis heterodúplex, mini-secuenciación y una diversidad de sistemas basados en sondas. Los ejemplos de tecnologías basadas en sondas incluyen balizas moleculares, el ensayo de 5'-exonucleasa, sondas de hibridación y cebadores Scorpion. Varios de estos sistemas de sondas se basan en la transferencia de energía entre los restos donante (p. ej., fluoróforo) y aceptor (p. ej., extintor de fluorescencia). Las sondas fluorescentes son típicamente oligonucleótidos monocatenarios que exhiben cantidades inferiores de emisión de fluorescencia en aislamiento que cuando se hibridan a secuencias diana. Las estructuras de estas sondas implican gran especificidad, permitiendo la identificación de dianas que difieren por tan solo un nucleótido sencillo.

La energía absorbida por un fluoróforo puede transferirse a un extintor de fluorescencia y liberarse como calor. La extinción de la señal de fluorescencia puede producirse por mecanismos de Transferencia de Energía por Resonancia en la Fluorescencia (Fluorescence Resonance Energy Transfer o FRET) o mecanismos distintos a la FRET. La extinción FRET requiere una superposición espectral entre el donante y el aceptor, donde la eficacia de la extinción se relaciona con la distancia entre los dos restos. La extinción no FRET se produce a través de "contactos" de corto intervalo entre el fluoróforo y el extintor, sin necesidad de superposición espectral entre los restos.

El ensayo 5'-exonucleasa (TaqMan^TM) usa extinción FRET para analizar el ADN diana amplificado por la Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR). Las sondas TaqMan son oligonucleótidos que contienen restos fluoróforo y extintor preferiblemente ubicados en los extremos 5' y 3'. Se emite muy poca fluorescencia desde la sonda intacta debido una extinción intramolecular eficaz. No obstante, durante la amplificación por PCR, la sonda se hibrida específicamente a su secuencia diana y la actividad de 5'- 3'-exonucleasa de la polimerasa Taq escinde la sonda entre los restos fluoróforo y extintor. La escisión enzimática de las sondas TaqMan^TM separa espacialmente los componentes fluoróforo y extintor, provocando incrementos significativos en la emisión de fluorescencia correlacionada con la amplificación diana. El cuidadoso diseño de las sondas TaqMan^TM permite la discriminación de dianas polimorfas, donde únicamente las sondas perfectamente emparejadas se degradan para generar incrementos en la señal de fluorescencia. Dado que las sondas TaqMan^TM se digieren durante la amplificación por PCR en tiempo real, las sondas no están disponibles para análisis de curvas de fusión post-amplificación.

Las balizas moleculares son sondas de oligonucleótidos monocatenarios que no son fluorescentes en aislamiento, pero que se tornan fluorescentes tras la hibridación a secuencias diana. Las balizas moleculares no hibridadas forman estructuras de tipo tallo-lazo (stem-loop), que poseen un fluoróforo covalentemente unido a un extremo de la molécula y un extintor unido al otro, de modo tal que la horquilla de la baliza coloca al resto fluoróforo próximo al extintor. Cuando las balizas moleculares se hibridan a secuencias diana, los restos fluoróforo y extintor se separan espacialmente, de modo tal que el fluoróforo ya no se extingue y fluoresce la baliza molecular. Las balizas moleculares se pueden emplear en ensayos de punto final y "tiempo real" para detección de secuencias y discriminación de SNP. La estructura secundaria de la baliza molecular transmite gran especificidad a la sonda de hibridación, permitiendo la identificación de dianas que difieren en un único nucleótido. No obstante, la interacción intramolecular de la sonda molecular produce una fuente potencial de competición para hibridación de dianas intermoleculares y, dado que la baliza molecular es una sonda interna, debe competir con la cadena opuesta del amplicón para unirse a la secuencia diana. La combinación de ambas formas de competición puede hbox{reducir la eficacia de la hibridación de la baliza molecular en algunas moléculas diana.}

Las sondas de hibridación son oligonucleótidos que están marcados solamente con un resto fluoróforo. Se requieren dos de dichos oligonucleótidos para cada ensayo de sonda de hibridación, uno marcado con un fluoróforo donante y el otro con un fluoróforo aceptor. Comúnmente se emplea fluoresceína como el donante y Cy5, LC-RED 640 y LC-RED 705 se utilizan comúnmente como aceptores. La excitación del fluoróforo donante produce un espectro de emisión que se superpone con el espectro de absorción del fluoróforo aceptor. Los pares de sondas de hibridación están diseñados para reconocer secuencias de nucleótidos adyacentes dentro de las moléculas diana. En aislamiento, el oligonucleótido aceptor no se excita y no genera una señal fluorescente. No obstante, durante la hibridación a las secuencias diana de polinucleótidos, las sondas donante y aceptor se aproximan, permitiendo la transferencia de energía por resonancia en la fluorescencia del donante al aceptor. La señal fluorescente desde el fluoróforo aceptor se emite únicamente cuando ambas sondas se hibridan a la molécula diana. Cuando se incorpora a reacciones PCR, la fluorescencia de la sonda aceptora se controla una vez por ciclo de amplificación, para facilitar la medición en tiempo real de acumulación de producto, donde la cantidad de fluorescencia emitida por el aceptor es proporcional a la cantidad de diana sintetizada. El cuidadoso diseño de las sondas y las condiciones de ensayo permiten la discriminación de dianas muy relacionadas por PCR en tiempo real. A su vez, se pueden emplear pares de sondas de hibridación para discriminar alelos por análisis de picos de fusión y determinación de Tm. Las muestras homocigóticas pueden identificarse por la generación de picos específicos durante el análisis de curvas... [Seguir leyendo]

1. Una baliza de hibridación que es un oligonucleótido donde (a) el oligonucleótido no posee estructura secundaria que surja de una región del oligonucleótido que se hibride con otra, (b) el oligonucleótido está formado por residuos nucleotídicos de los cuales más de uno está marcado con un indicador fluorescente en el que la baliza no incluye un extintor asociado y el indicador se selecciona entre el grupo de 6-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína y hexaclorofluoresceína, (c) los residuos nucleotídicos marcados con indicador están posicionados internamente dentro de la secuencia oligonucleotídica, (d) el oligonucleótido es totalmente complementario a un alelo de ADN genómico humano que tiene un polimorfismo conocido en el sitio de unión del oligonucleótido, y (e) la sonda oligonucleotídica está modificada en su extremo 3' como para prevenir la extensión de la cadena durante la amplificación por PCR.

2. La baliza de hibridación según la reivindicación 1, en la que el polimorfismo es una mutación puntual o una inserción o deleción de una sola base.

3. La baliza de hibridación según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el polimorfismo conocido es complementario a un residuo nucleotídico ubicado centralmente dentro de la molécula baliza de hibridación.

4. La baliza de hibridación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que está inmovilizada en un soporte.

5. Una gama de sondas oligonucleotídicas inmovilizadas en ubicaciones espaciadas en o dentro de un soporte, en las que diferentes sondas oligonucleotídicas son diferentes balizas de hibridación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. El uso de una baliza de hibridación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para detectar polimorfismos en ADN humano.

7. Un método para elaborar una baliza de hibridación que es un oligonucleótido, comprendiendo el método

(i) seleccionar una diana polinucleotídica;

(ii) designar un oligonucleótido totalmente complementario a la diana polinucleotídica y donde (a) el oligonucleótido no tiene estructura secundaria que surja de una región del oligonucleótido que se hibride a otra, (b) el oligonucleótido está formado por residuos nucleotídicos de los cuales más de uno está marcado con un indicador fluorescente en el que la baliza no incluye un extintor asociado y el indicador se selecciona del grupo de 6-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína y hexaclorofluoresceína, (c) los residuos nucleotídicos marcados con indicador están posicionados internamente dentro de la secuencia oligonucleotídica, y (d) la sonda oligonucleotídica está modificada en su extremo 3' como para prevenir la extensión de la cadena durante la amplificación por PCR; y (iii) sintetizar dicha baliza de hibridación.

8. Un método para investigar una diana polinucleotídica, donde el método comprende

(i) proveer una baliza de hibridación que es un oligonucleótido donde (a) el oligonucleótido no posee estructura secundaria que surja de una región que se hibrida con otra, (b) el oligonucleótido está formado por residuos nucleotídicos de los cuales más de uno está marcado con un indicador fluorescente en el que la baliza no incluye un extintor asociado y el indicador se selecciona del grupo de 6-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína y hexaclorofluoresceína, (c) los residuos nucleotídicos marcados con indicador están ubicados internamente dentro de la secuencia oligonucleotídica, (d) el oligonucleótido es totalmente complementario a la diana polinucleotídica, y (e) la sonda oligonucleotídica está modificada en su extremo 3' como para prevenir la extensión de la cadena durante la amplificación por PCR;

(ii) incubar la diana polinucleotídica con la baliza de hibridación exhibiendo un nivel superior de señal cuando está en la forma de híbrido que cuando está la forma monocatenaria; y

(iii) observar el nivel de señal de la baliza de hibridación a una temperatura predeterminada, o en un intervalo de temperaturas, cercano a la temperatura de fusión del híbrido.

9. Un método según la reivindicación 8, en el que la diana polinucleotídica tiene un polimorfismo conocido o sospechado.

10. El método según las reivindicaciones 8 ó 9, en el que el método se utiliza para detectar, identificar o cuantificar la presencia o cantidad de secuencia diana presente en una muestra.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la baliza de hibridación tiene una secuencia complementaria a un alelo del polinucleótido diana.

12. El método según la reivindicación 11, en el que se proveen dos o más balizas de hibridación diferentes, teniendo, cada una, una secuencia complementaria a un alelo diferente del polinucleótido diana.

13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que la temperatura predeterminada, en la cual se observa el nivel de señal de la baliza de hibridación, es intermedio a las temperaturas de fusión de los híbridos formados con los diferentes alelos de la diana polinucleotídica.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que el intervalo de temperaturas, en el cual se observa el nivel de señal de la baliza de hibridación, abarca la temperatura de fusión del híbrido.

15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, y 14, en el que se realiza la observación del índice de cambio del nivel de señal con el cambio de temperatura.

16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en el que la diana polinucleotídica es un amplímero de PCR.

17. El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, en el que la amplificación de la diana polinucleotídica se realiza en presencia de la baliza de hibridación.

18. El método según la reivindicación 17, en el que la amplificación del polinucleótido se realiza por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR), Amplificación por Desplazamiento de Cadena (Strand Displacement Amplification o SDA), Amplificación Mediada por Transcripción (Transcription Mediated Amplification o TMA), Amplificación por Círculo Rodador (Rolling Circle Amplification o RCA) o Amplificación Basada en la Secuencia del Ácido Nucleico (Nucleic Acid Sequence Bases Amplification o NASBA).

19. El método según las reivindicaciones 17 ó 18, en el que la observación de la señal de la baliza de hibridación se realiza durante la amplificación de la diana polinucleotídica.

20. El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 19, en el que las balizas de hibridación se emplean para detectar y discriminar dianas amplificadas a partir de muestras, tales como saliva, sin extracción previa de ADN.

21. El método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que la reacción PCR es una amplificación asimétrica.

22. El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 21, en el que la baliza de hibridación, la secuencia diana o ambas están inmovilizadas en un soporte.

23. El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 22, en el que el método se utiliza en la diferenciación entre dianas polinucleotídicas homocigóticas y heterocigóticas.