Un método para determinar el riesgo de un individuo de padecer osteoporosis,

que comprende: la detección de la presencia de al menos un polimorfismo relacionado con la osteoporosis en un gen FRZB en una muestra de ácido nuclei- co del individuo, en el que la presencia de al menos dicho polimorfismo proporciona una indicación del riesgo del in- dividuo de padecer osteoporosis, y en el que al menos un polimorfismo se selecciona de entre el grupo que consiste en: alelo C de C18679T, alelo T de C18679T, alelo G de G19524A, alelo A de G19524A, alelo A de A24791G, alelo G de A24791G, alelo C de C26794G, alelo G de C26794G, alelo G de G27014A y alelo A de G27014A

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención está relacionada con métodos y reactivos para detectar el riesgo de un individuo de padecer osteoporosis. Más en concreto, está relacionada con los métodos y reactivos para detectar el aumento o descenso de riesgo de un individuo de sufrir osteoporosis mediante la identificación de la presencia de al menos un polimorfismo en el gen FRZB.

ANTECEDENTES OF LA INVENCIÓN

Los experimentos de transplantes de Spemann y Mangold (1924, Arch. Mikroskopische Anat. Entwicklungsmechanik, 100:599638) establecieron la presencia de una región anatómica concreta, el organizador Spemann, o labio dorsal, que controla el patrón de desarrollo del eje corporal en los embriones de los vertebrados. Se encontró que los factores difundibles que salen de esta región están involucrados en diferentes procesos del desarrollo. La distribución de los pelos de la cutícula de Drosophila en una polaridad definida se encontró que estaba genéticamente controlada por "frizzled" (FZD1), un receptor transmembrana de 7 lazos con un gran dominio extracelular rico en cisteínas.

Los homólogos bovinos y humanos de FZD1 se clonaron mediante RT-PCR y mediante el cribaje de bibliotecas de cDNA de cartílago articular bovino y de placenta humana, que identificaron cDNA que codifican por FRZB, el análogo de mamífero de FZD1

(Hoang et al., 1996, J. Biol. Chem., 271:26131-26137). Las proteínas deducidas de 325 aminoácidos de FRZB bovino y humano comparten el 94% de identidad de aminoácidos. El análisis de las secuencias predijo que FRZB contiene un péptido señal de 25 aminoácidos, un sitio de N-glicosilación en N-terminal, un segmento transmembrana putativo de 24 aminoácidos, una región con múltiples sitios potenciales de fosforilación Ser/Thr, y un dominio C-terminal rico en serina. La región N-terminal de FRZB comparte el 50% de identidad de aminoácidos, incluyendo la conservación de los 10 residuos de Cys, con frizzled. El análisis por inmunoblot determinó que FRZB se expresa como una proteína de aproximadamente 36-kD. El análisis de hibridación in situ de los embriones humanos que representa las diferentes etapas de desarrollo, no detectaron expresión desde la semana 6 hasta la semana 13 excepto en el esqueleto apendicular en desarrollo, así como en varios huesos craneofaciales y extremos epifíseos de la caja torácica. El análisis inmunohistoquímico confirmó la expresión de FRZB en las estructuras esqueléticas en desarrollo.

El análisis Northern blot reveló que FRZB se expresa fuertemente en la placenta y el corazón, de forma moderada en el cerebro, músculo esquelético, riñón, y páncreas, y a niveles bajos en los pulmones e hígado (Leyns et al., 1997, Cell 88:747-756). El análisis SDS-PAGE detectó secreción de FRZB, posiblemente tras la escisión proteolítica, consistente con la falta de FRZB de los 7 dominios transmembrana encontrados en Drosophila y en la familia génica frizzled de vertebrados. EL análisis funcional en los embriones de Xenopus mostró que FRZB puede antagonizar los efectos iniciales y tardíos de la señalización de WNT8. Los genes WNT

de mamíferos incluye oncogenes que conducen a tumores en mamíferos. Para una mayor caracterización de FRZB, véase, por ejemplo, Dann et al., 2001, Nature 412:86-90; Rattner et al., 1997, Proc. Nat. Acad. Sci. 94:2859-2863; y Schumann et al., 2000, Cardiovasc. Res. 45:720-728.

Leyns et al. (supra) mapearon el gen FRZB humano en 2q31q33. Encontraron que la pérdida de una copia en el brazo 2q ocurre con una gran incidencia en los carcinomas de pulmón y colo-rectal, así como en neuroblastomas, y sugiere que FRZB puede funcionar como un gen supresor de tumores. Hoang et al. (supra) sugirió que FRZB puede jugar un papel en la morfogénesis del esqueleto. No obstante, no se ha identificado un papel directo para el gen FRZB en la enfermedad humana y el desarrollo.

J. Loughlin et al (Rheumatology (2002); 41: 955-956) describe un estudio que localiza el locus de susceptibilidad genética de la osteoartritis de cadera en el cromosoma 2q24.3-q31.1. CJ Ciesielski et al (Arthritis and Rheumatism vol. 46, nº 9, (2002), página S274) describe 4 SNP en el gen FRZB que se encontró en pacientes con osteoartritis.

Entre otros aspectos, la presente invención proporciona alelos de FRZB, identificados por la presencia de uno o más polimorfismos de predisposición o protectores, que están asociados con una aumento o descenso del riesgo de osteoporosis. Se obtendrá un completo entendimiento de la invención tras revisar lo que viene a continuación.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona métodos, reactivos y equipos para

detectar un aumento o descenso del riesgo de un individuo para

enfermedades osteoporóticas y enfermedades relacionadas. En ciertas realizaciones, se utilizan los métodos para determinar el riesgo de un individuo para la osteoporosis y enfermedades relacionadas. En otras realizaciones, los métodos para determinar el riego se combina con métodos clínicos conocidos para diagnosticar la osteoporosis.

Una clase general de realizaciones proporciona métodos para determinar el riesgo de un individuo por la osteoporosis. En los métodos, se detecta la presencia de al menos un polimorfismo relacionado con la osteoporosis en el gen de la proteína relacionada con frizzled (FRZB) en una muestra de ácidos nucleicos del individuo. La presencia de al menos un polimorfismo proporciona una indicación del riesgo del individuo para la osteoporosis. El riesgo de un individuo para la osteoporosis puede ser, por ejemplo, un aumento del riesgo o una disminución del riesgo si se compara con un individuo sin al menos un polimorfismo (por ejemplo, un individuo con un alelo diferente en el sitio del polimorfismo). De acuerdo con esto, al menos un polimorfismo puede comprender un polimorfismo de predisposición o de protección en el gen FRZB.

El polimorfismo puede comprender en esencia cualquier polimorfismo(s) adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, DNA polimórfico amplificado aleatorio, polimorfismos de longitud de fragmentos arbitrarios, repeticiones de secuencias sencillas, polimorfismos de conformación de cadenas sencillas, y secuencias variables amplificadas. En una clase preferible de realizaciones, el polimorfismo comprende al menos un polimorfismo de nucleótido único

(SNP). Por ejemplo, el polimorfismo puede ser un alelo de T2303723C, C18679T, G19524A, T19575G, T22242A, G23043A, G23415A, T23549C, A24791G, C26794G, o G27014A. En una clase de realizaciones, el al menos un polimorfismo se selecciona del grupo que consiste en: alelo C de C18679T, alelo T de C18679T, alelo G de G19524A, alelo A de G19524A, alelo A de A24791G, alelo G de A24791G, alelo C de C26794G, alelo G de C26794G, alelo G de G27014A, y alelo A de G27014A.

En una clase de realizaciones, la presencia de dos o más polimorfismos se detecta (por ejemplo, dos o más polimorfismos en un sitio único de polimorfismo y/o en sitios diferentes de polimorfismo, por ejemplo, un haplotipo). Al menos uno de dos o más polimorfismos (por ejemplo, todos los polimorfismos) se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en: el alelo C de C18679T, el alelo T de C18679T, el alelo G de G19524A, el alelo A de G19524A, el alelo A de A24791G, el alelo G de A24791G,el alelo C de C26794G, el alelo G de C26794G, el alelo G de G27014A, y el alelo A de G27014A.

La muestra de ácido nucleico normalmente comprende DNA o RNA. La presencia de al menos un polimorfismo en la muestra de ácido nucleico puede detectarse mediante cualquier método conocido en la materia. Por ejemplo, el polimorfismo puede detectarse secuenciando, por ejemplo, secuenciando la región del gen FRZB que incluye los sitio(s) polimórficos. La región de FRZB se amplifica opcionalmente antes del paso de secuenciación. Como otro ejemplo, el polimorfismo se detecta mediante amplificación, por ejemplo, de la región del gen FRZB que incluye los sitio(s) polimórficos. La amplificación puede ser, por ejemplo, una amplifica

ción específica de alelo. La amplificación puede comprender una reacción en cadena de la polimerasa (por ejemplo, una PCR cinética), una reacción en cadena de la ligasa o similares. En otro ejemplo, el polimorfismo puede detectarse mediante hibridación de una sonda de ácido nucleico. Así, en una clase de realizaciones, para detectar el polimorfismo, la muestra de ácido nucleico se pone en contacto con al menos un oligonucleótido...

1. Un método para determinar el riesgo de un individuo de padecer osteoporosis, que comprende: la detección de la presencia de al menos un polimorfismo relacionado con la osteoporosis en un gen FRZB en una muestra de ácido nucleico del individuo, en el que la presencia de al menos dicho polimorfismo proporciona una indicación del riesgo del individuo de padecer osteoporosis, y en el que al menos un polimorfismo se selecciona de entre el grupo que consiste en: alelo C de C18679T, alelo T de C18679T, alelo G de G19524A, alelo A de G19524A, alelo A de A24791G, alelo G de A24791G, alelo C de C26794G, alelo G de C26794G, alelo G de G27014A y alelo A de G27014A.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el conjunto de al menos un polimorfismo comprende dos o más polimorfismos.

3. El método de la reivindicación 2, en el que los dos

o más polimorfismos se seleccionan de entre el grupo que consiste en: alelo C de C18679T, alelo T de C18679T, alelo G de G19524A, alelo A de G19524A, alelo A de A24791G, alelo G de A24791G, alelo C de C26794G, alelo G de C26794G, alelo G de G27014A y alelo A de G27014A.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el conjunto de al menos un polimorfismo se detecta mediante secuenciación.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el conjunto de al menos un polimorfismo se detecta mediante amplificación.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la detección comprende:

- poner en contacto la muestra de ácido nucleico con al menos un oligonucleótido específico de secuencia bajo condiciones que permiten la unión del oligonucleótido a la muestra de ácido nucleico, en el que el conjunto de al menos un oligonucleótido específico de secuencia hibrida bajo condiciones astringentes con una región del gen FRZB que comprende el conjunto de al menos un polimorfismo relacionado con la osteoporosis; y,

- detectar la hibridación del conjunto de al menos un oligonucleótido específico de secuencia con la muestra de ácido nucleico.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la detección comprende:

- amplificar la muestra de ácido nucleico, proporcionando así una muestra de ácido nucleico amplificado;

- poner en contacto la muestra de ácido nucleico amplificado con al menos un oligonucleótido específico de secuencia bajo condiciones que permiten la unión del oligonucleótido a la muestra de ácido nucleico amplificado, en el que el conjunto de al menos un oligonucleótido específico de secuencia hibrida bajo condiciones astringentes con una región del gen FRZB que comprende el conjunto de al menos un polimorfismo relacionado con la osteoporosis; y,

- detectar la hibridación del conjunto de al menos un oligonucleótido específico de secuencia con la muestra de ácido nucleico amplificado.

8. Un método para determinar el riesgo de un individuo de padecer osteoporosis, método que comprende: determinar el genotipo del individuo en uno o más sitios polimórficos en un gen FRZB, en el que un primer genotipo en dichos uno

o más sitios polimórficos está asociado estadísticamente con un aumento del riesgo de padecer osteoporosis comparado con un segundo genotipo en dichos uno o más sitios polimórficos, y en el que dicho primer genotipo comprende dos ale-los C y dicho segundo genotipo comprende dos alelos T o un alelo T y un alelo C del SNP C18679T, dicho primer genotipo comprende dos alelos G y dicho segundo genotipo comprende dos alelos A o un alelo A y un alelo G del SNP G 19524A, dicho primer genotipo comprende dos alelos A y dicho segundo genotipo comprende dos alelos G o un alelo G y un alelo A del SNP A24791G, dicho primer genotipo comprende dos ale-los C y dicho segundo genotipo comprende dos alelos G o un alelo C y un alelo G del SNP C26794G, y/o dicho primer genotipo comprende dos alelos G y dicho segundo genotipo comprende dos alelos A o un alelo G y un alelo A del SNP G27014A.

9. Un equipo para detectar la presencia de un primer polimorfismo de predisposición o protector en un gen FRZB en una muestra de ácido nucleico de un individuo cuyo riesgo de padecer osteoporosis se está valorando, y el equipo comprende: uno o más oligonucleótidos iniciales capaces de detectar dicho primer polimorfismo e instrucciones para detectar dicho primer polimorfismo con dicho conjunto de uno

o más oligonucleótidos iniciales y para correlacionar dicha

detección con el riesgo del individuo de padecer osteoporosis, empaquetado en uno o más contenedores; en el que dicho primer polimorfismo se selecciona de entre el grupo que consiste en: alelo C de C18679T, alelo T de C18679T, alelo G de G19524A, alelo A de G19524A, alelo A de A24791G, alelo G de A24791G, alelo C de C26794G, alelo G de C26794G, alelo G de G27014A y alelo A de G27014A, y en el que dicho polimorfismo de predisposición comprende el alelo C del SNP C18679T, el alelo G del SNP G19524A, el alelo A del SNP A24791G, el alelo C del SNP C26794G, y/o el alelo G del SNP G27014A y/o dicho polimorfismo protector comprende el alelo T del SNP C18679T, el alelo A del SNP G19524A, el alelo G del SNP A24791G, el alelo G del SNP C26794G y/o el alelo A del SNP G27014A.

10. El equipo de la reivindicación 9, en el que el conjunto de uno o más oligonucleótidos iniciales comprende al menos una sonda.

11. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 9

o 10, en el que los oligonucleótidos iniciales son completamente complementarios a la región del gen FRZB que comprende el primer polimorfismo.

12. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones de 9 a 11, en el que el conjunto de uno o más de los oligonucleótidos iniciales comprende uno o más cebadores.

13. Un chip para detectar la presencia de uno o más polimorfismos de predisposición y/o protectores en un gen FRZB en una muestra de ácido nucleico de un individuo cuyo riesgo de padecer osteoporosis se está valorando, y que

comprende:

- una serie de oligonucleótidos, en la que cada uno de los oligonucleótidos hibrida con una región del gen FRZB que comprende al menos uno de los polimorfismos, en la que

5  dicha hibridación detecta la presencia del polimorfismo, y en la que dicha detección proporciona una indicación del riesgo del individuo de padecer osteoporosis; y,

- un sustrato sobre el que se inmovilizan la serie de oligonucleótidos y en el que se selecciona al menos uno de

10  entre el conjunto de uno o más polimorfismos del grupo que consiste en: alelo C de C18679T, alelo T de C18679T, alelo G de G19524A, alelo A de G19524A, alelo A de A24791G, alelo G de A24791G, alelo C de C26794G, alelo G de C26794G, alelo G de G27014A y alelo A de G27014A.

15  14. Un sistema, que comprende: el chip de la reivindicación 13 y las instrucciones del sistema para correlacionar dicha detección de la presencia de uno o más polimorfismos de predisposición o protectores con el riesgo del individuo de padecer osteoporosis.