ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C que comprende partes del ARN genómico de dos o más cepas de virus de la hepatitis C,

el cual comprende una región no traducida 5', una secuencia codificante de la proteína del núcleo, una secuencia codificante de la proteína E1, una secuencia codificante de la proteína E2, una secuencia codificante de la proteína p7, una secuencia codificante de la proteína NS2, una secuencia parcial del ARN que codifica las proteínas NS3, NS4, NS5A y NS5B de una cepa JFH1 mostrada en la SEQ ID NO: 1 y una región no traducida 3', y que se puede replicar de forma autónoma, donde una de las cepas del virus de la hepatitis C es una cepa viral de genotipo 1b

Campo de la Técnica

La presente invención se refiere a: un método para replicar de forma autónoma el virus humano de la hepatitis C (VHC) con diversos genotipos en un sistema celular cultivado; al ARN genómico del VHC modificado utilizado para ello; y a células que replican el ARN genómico del VHC descrito anteriormente.

Antecedentes de la Técnica

Como resultado de estudios recientes, ha quedado claro que el virus de la hepatitis C se clasifica en un gran número de tipos, dependiendo del genotipo o serotipo. De acuerdo con el método de filoanálisis de Simmonds y col., que utiliza secuencias de nucleótidos de cepas de VHC, método que se está utilizando actualmente como principal método para la clasificación de los genotipos del VHC, el VHC se clasifica en los 6 tipos siguientes: genotipo 1a, genotipo 1b, genotipo 2a, genotipo 2b, genotipo 3a y genotipo 3b (Documento de No-Patente 1). Estos tipos se clasifican además en varios subtipos. Se han determinado también las secuencias de nucleótidos de los genomas de longitud completa de numerosos genotipos del VHC (Documento de Patente 1 y Documentos de No-Patente 2 a 4).

El VHC provoca hepatitis crónica como consecuencia de una infección persistente. Una causa principal de la hepatitis crónica, reconocida a escala global, es la infección persistente por VHC. De hecho, aproximadamente un 50% de pacientes infectados persistentemente desarrolla hepatitis crónica y aproximadamente un 20% de los pacientes evoluciona a hepatocirrosis a partir de 10 a 20 años. Además, algunos de estos pacientes desarrollan condiciones patológicas fatales, por ejemplo cáncer de hígado.

Actualmente, los principales tratamientos contra la hepatitis C incluyen la utilización de interferón o interferón- y la utilización combinada de interferón- con ribavirina, que es un derivado del nucleósido purina. Sin embargo, aunque se aplican estos tratamientos en pacientes, sólo se observan sus efectos terapéuticos en aproximadamente un 60% de tales pacientes. Cuando los tratamientos se terminan después de haber obtenido dichos efectos terapéuticos, más de la mitad de los pacientes desarrolla la enfermedad recurrente. Se ha sabido que los efectos terapéuticos del interferón dependen del genotipo de VHC. Esto es, se dice que los efectos del interferón son escasos en el genotipo 1b y que sus efectos son elevados en el genotipo 2a (Documento de No-Patente 5). Además, la especificidad de sustrato de la proteasa del VHC varía dependiendo del genotipo. La actividad inhibidora de un inhibidor desarrollado mediante la proteasa NS3 del genotipo 1b es 50 veces inferior o más a la que se desarrolla mediante las proteasas NS3 de otros genotipos (Documento de No-Patente 6). En consecuencia, con el fin de desarrollar un agente terapéutico del VHC eficaz, se requiere desarrollar el agente al mismo tiempo que se confirma la reactividad de cada uno de los genotipos del VHC.

Recientemente, se ha obtenido un replicón de ARN subgenómico de VHC como un ARN derivado de VHC que se puede replicar de forma autónoma (Documentos de Patente 2 y 3 y Documentos de No-Patente 7 a 9). Por este medio, ya es posible analizar los mecanismos de replicación del VHC utilizando células cultivadas. Dicho replicón de ARN subgenómico de VHC se obtiene mediante la sustitución de una proteína estructural presente aguas abajo del IRES del VHC, en la región no traducida 5' del ARN genómico del VHC, con un gen de resistencia a la neomicina, y el EMCV-IRES que está ligado aguas abajo al mismo. Este replicón de ARN se introdujo en células humanas de cáncer de hígado Huh7 y luego se cultivaron las células en presencia de neomicina. Como consecuencia, se demostró que el replicón de ARN se replicaba de forma autónoma en las células Huh7. Además, también se demostró que varios replicones de ARN subgenómico de VHC se replicaban de forma autónoma en células distintas de Huh7, tales como células humanas de cáncer cervical HeLa o células humanas de cáncer de hígado HepG2 (Documento de Patente 3).

Sin embargo, dichos sistemas de replicación de ARN intracelular del VHC se ha obtenido para genotipos limitados, o más bien, se han obtenido dichos sistemas sólo por medio de ARN genómico de un número limitado de cepas de VHC. Por tanto, con respecto al VHC con un gran número de genotipos, resulta extremadamente difícil analizar las diferencias en los efectos terapéuticos de los agentes terapéuticos desarrollados contra el VHC que son provocados por diferencias en los genotipos de los agentes mencionados anteriormente. Dicho replicón de ARN es un sistema experimental que sólo sirve para evaluar la replicación del ARN del virus durante el proceso de crecimiento y replicación del virus VHC. Por tanto, es imposible que dicho replicón de ARN evalúe procesos tales como la formación de partículas del virus VHC en una célula infectada, la liberación del mismo fuera de la célula o la infección de una nueva célula.

Actualmente, la aplicación de un método para evaluar procesos tales como la formación de partículas del virus VHC, la liberación del mismo fuera de la célula y la infección de nuevas células se limita a un sistema experimental empleando animales, por ejemplo chimpancés (Documento de No-Patente 10). Sin embargo, este sistema experimental en el que se utilizan directamente cuerpos de animales vivos implica operaciones complicadas y, por tanto, es extremadamente difícil llevar a cabo análisis con dicho sistema experimental. En consecuencia, con el fin de analizar procesos tales como la formación de partículas del virus VHC, la liberación del mismo fuera de la célula y la infección de nuevas células, o con el fin de desarrollar un agente anti-VHC que utilice la inhibición de estos procesos como mecanismo de acción, es necesario elaborar un sistema experimental extremadamente simplificado capaz de replicar estos procesos; a saber, un sistema de replicación de partículas del virus VHC que utilice un sistema de células cultivadas.

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Si fuera posible suministrar de forma estable partículas del virus VHC procedentes de dicho sistema de células cultivadas, el virus podría ser atenuado, o podría producirse un virus VHC no infeccioso por medios basados en la biología molecular, utilizando así dichos virus como vacunas. Sin embargo, debido a que las secuencias proteicas del VHC son diferentes según el genotipo, la antigenicidad del VHC también es diferente según el genotipo. De hecho, la presencia de varios genotipos constituye un impedimento significativo a la producción de vacunas contra el VHC (Documento de No-Patente 11). Por tanto, con el fin de producir eficazmente vacunas contra el VHC también se desea que las partículas del virus VHC con varios genotipos se produzcan de forma estable en un sistema de células cultivadas.

Es sabido que el VHC es una partícula esférica de un tamaño de entre 55 y 65 nm que existe en la sangre de un paciente infectado por HVC. Como método para purificar el VHC presente en el suero humano, se conoce la cromatografía de afinidad que utiliza lectina (Documento de No-Patente 12) y la cromatografía que utiliza heparina (Documento de No-Patente 13). Sin embargo, mediante estos métodos, sólo se puede purificar menos de 1 ml de virus a una concentración de aproximadamente 1M copias/ml. Por tanto, estos métodos no son aplicables industrialmente.

Se han diseñado hasta la fecha diversos métodos para purificar partículas virales distintas del VHC (Documentos de Patente 4, 5, y 6, por ejemplo). Sin embargo, como queda claro a partir de estas publicaciones, las partículas virales tienen diferentes propiedades y, por tanto, las partículas no dan una información útil sobre cuál sería un método óptimo para purificar el virus humano de la hepatitis C. El Documento de Patente 7 describe que el virus de la hepatitis A humana, que es también un virus de la hepatitis, se puede purificar mediante la eliminación de ADN según cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, aunque el virus de la hepatitis A es también un virus de la hepatitis, es un virus que tiene ADN como gen. Como queda claro a partir del hecho de que el virus de la hepatitis C tiene ARN como gen, no existen similitudes relevantes entre el virus de la hepatitis A y el virus de la hepatitis C y, por tanto, no se da ninguna información con respecto a métodos relevantes de purificación. Con el fin de utilizar partículas virales de la hepatitis C humana como vacunas o similares en el campo industrial en el futuro, se requiere purificar a alto nivel dichas partículas en un gran volumen.... [Seguir leyendo]

1. ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C que comprende partes del ARN genómico de dos o más cepas de virus de la hepatitis C, el cual comprende una región no traducida 5', una secuencia codificante de la proteína del núcleo, una secuencia codificante de la proteína E1, una secuencia codificante de la proteína E2, una secuencia codificante de la proteína p7, una secuencia codificante de la proteína NS2, una secuencia parcial del ARN que codifica las proteínas NS3, NS4, NS5A y NS5B de una cepa JFH1 mostrada en la SEQ ID NO: 1 y una región no traducida 3', y que se puede replicar de forma autónoma, donde una de las cepas del virus de la hepatitis C es una cepa viral de genotipo 1b.

2. ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C que comprende partes del ARN genómico de dos o más cepas de virus de la hepatitis C, el cual comprende una región no traducida 5', una secuencia codificante de la proteína del núcleo, una secuencia codificante de la proteína E1, una secuencia codificante de la proteína E2, una secuencia codificante de la proteína p7, una secuencia codificante de la proteína NS2, una secuencia codificante de la proteína NS3, una secuencia codificante de la proteína NS4A, una secuencia codificante de la proteína NS4B, una secuencia codificante de la proteína NS5A, una secuencia codificante de la proteína NS5B de una cepa JFH1 mostrada en la SEQ ID NO: 2 y una región no traducida 3', y que se puede replicar de forma autónoma, donde una de las cepas del virus de la hepatitis C es una cepa viral de genotipo 1b.

3. ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la cepa viral de genotipo 1b se selecciona de entre una cepa VHC-con1, una cepa VHCTH, una cepa VHC-J, una cepa VHC-JT y una cepa VHC-BK.

4. ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dichas una de las cepas del virus de la hepatitis C es una cepa VHC-con1 de genotipo 1b.

5. ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C según la reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia que codifica la proteína E1, la proteína E2, la proteína p7 y la proteína NS2 de la cepa VHC-con1 está ligada aguas abajo de la región no traducida 5' de la cepa JFH1 y, aguas abajo de la misma, la secuencia que codifica las proteínas NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B de la cepa JFH1 y, aguas abajo de la misma, la región no traducida 3' de la cepa JFH1.

6. ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha una de las cepas del virus de la hepatitis C es una cepa VHC-TH de genotipo 1b.

7. ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C según la reivindicación 6, que comprende la secuencia de nucleótidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 11.

8. ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C que comprende partes del ARN genómico de dos cepas de virus de la hepatitis C, caracterizado porque dichas cepas del virus de la hepatitis C son una cepa JPH1 y la cepa JCH1, y dicho ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C comprende una secuencia que corresponde a 1 hasta 3866 de la secuencia del Nº de Acceso del GenBank AB047640 ligada a una secuencia que corresponde a 3867 hasta 9678 de la secuencia del Nº de Acceso del GenBank AB047639, y que se puede replicar de forma autónoma.

9. Vector viral dirigido a células hepáticas, que comprende el ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Célula en la que se introduce el ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y que replica el ARN genómico del virus de la hepatitis C y puede generar partículas virales.

11. Partículas virales de la hepatitis C, que se obtienen a partir de un cultivo obtenido mediante el cultivo de la célula según la reivindicación 10.

12. Método para purificar partículas de VHC sometiendo un líquido o un producto obtenido a partir del homogenato de células que contiene partículas del VHC según la reivindicación 11 a una cromatografía en columna y/o centrifugación en gradiente de densidad utilizadas en combinación.

13. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque la cromatografía en columna es de uno

o varios tipos de cromatografías seleccionados de entre cromatografía por intercambio iónico, cromatografía por filtración en gel y cromatografía de afinidad.

14. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque la cromatografía de intercambio iónico es de uno o varios tipos de cromatografías seleccionados de entre cromatografía aniónica y

cromatografía catiónica, la cromatografía por filtración en gel es de uno o varios tipos de cromatografías utilizando una resina seleccionada de entre Sephacryl-S300(R), SephacrylS400(R) y Sephacryl-S500(R), y la cromatografía de afinidad es de uno o varios tipos de cromatografías utilizando una resina seleccionada de entre celulofina sulfatada, heparina y lectina.

15. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque la cromatografía es cromatografía en celulofina sulfatada.

16. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque la centrifugación en gradiente de densidad se lleva a cabo utilizando uno o varios solutos seleccionados de entre cloruro de cesio, sacarosa y polímeros de azúcar.

17. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque, en el método de purificación, la cromatografía por intercambio aniónico, la cromatografía en celulofina sulfatada y la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa se llevan a cabo, al menos una vez, respectivamente, y combinadas en cualquier orden.

18. Partículas de VHC, que se obtienen por medio de un método para purificar partículas de VHC, caracterizadas porque un líquido o una solución obtenida a partir del homogenato de células que contiene partículas de VHC según la reivindicación 11 se somete a cromatografía en columna y a centrifugación en gradiente de densidad utilizadas en combinación.

19. Partículas de VHC según la reivindicación 18, caracterizadas porque la cromatografía en columna es de uno o varios tipos de cromatografías seleccionados de entre cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por filtración en gel y cromatografía de afinidad.

20. Partículas de VHC según la reivindicación 18, caracterizadas porque la cromatografía de intercambio iónico es de uno o varios tipos de cromatografías seleccionados de entre cromatografía aniónica y cromatografía catiónica, la cromatografía por filtración en gel es de uno

**(Ver fórmula)**

o varios tipos de cromatografías utilizando una resina seleccionada de entre Sephacryl-S300(R), Sephacryl-S400(R), y Sephacryl-S500(R), y la cromatografía de afinidad es de uno o varios tipos de cromatografías utilizando una resina seleccionada de entre celulofina sulfatada, heparina, y lectina.

21. Partículas de VHC según la reivindicación 18, caracterizadas porque la cromatografía es cromatografía en celulofina sulfatada.

22. Partículas de VHC según la reivindicación 18, caracterizadas porque la centrifugación en gradiente de densidad se lleva a cabo utilizando uno o varios solutos seleccionados de entre cloruro de cesio, sacarosa y polímeros de azúcar.

23. Partículas de VHC según la reivindicación 18, que se purifican por medio del método de purificación, donde la cromatografía por intercambio aniónico, la cromatografía en celulofina sulfatada y la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa se llevan a cabo en combinación.

24. Utilización de partículas virales de la hepatitis C según la reivindicación 11 ó 18 como antígenos para producir una vacuna contra la hepatitis C y/o un anticuerpo neutralizante.

25. Célula infectada por el virus de la hepatitis C, que está infectada por partículas virales de la hepatitis C según la reivindicación 11 ó 18.

26. Método para producir una partícula viral de la hepatitis C, caracterizado porque el método comprende el cultivo de la célula según la reivindicación 10 y la recuperación de las partículas virales del cultivo.

27. Método para producir una célula infectada por el virus de la hepatitis C, caracterizado porque el método comprende el cultivo de la célula según la reivindicación 10, la recuperación de un sobrenadante del cultivo de la célula y la aplicación del sobrenadante a otra célula para infectar dicha otra célula con partículas virales contenidas en el sobrenadante del cultivo.

28. Método para cribar una sustancia antivirus de la hepatitis C, caracterizado porque el método comprende el cultivo de la célula según la reivindicación 10 ó 25 en presencia de una sustancia de prueba y la detección del ARN del virus de la hepatitis C o partículas virales en el cultivo, evaluando así los efectos del antivirus de la hepatitis C en la sustancia de prueba.

29. Método para producir una vacuna contra la hepatitis C y/o anticuerpos neutralizantes mediante la utilización de partículas virales de la hepatitis C según la reivindicación 11 ó 18 como antígenos.

30. Método para replicar y/o expresar un gen extraño en una célula, caracterizado porque el método comprende la inserción del ARN que codifica el gen extraño dentro del ARN genómico del virus modificado de la hepatitis C según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y la introducción del ARN genómico en una célula de interés, para replicar o expresar el gen extraño en su interior.