Un anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo que se une a un epitope situado dentro de los aminoácidos 16-198 de la secuencia de EphB4 de la Figura 1,

que inhibe la interacción entre EphB4 y Efrina B2, y que promueve la apoptosis en una célula tumoral

La presente invención se refiere a un anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo que se une a un epitope situado dentro de los aminoácidos 16-198 de la secuencia EphB4 de la Figura 1, que inhibe la interacción entre EphB4 y EfrinaB2, y que promueve la apoptosis en una célula tumoral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

EphB4, algunas veces mencionada como el receptor de efrina B4 o quinasa de transmembrana de hepatoma (HTK), pertenece a una familia de receptores de transmembrana de proteína tirosina quinasa. EphB4 tiene un dominio extracelular compuesto del dominio de unión al ligando (también denominado como dominio globular), un dominio rico en cisteína, y un par de repeticiones de fibronectina tipo III (por ejemplo, ver Figura 5). El dominio citoplásmico consiste en una región de yuxtamembrana que contiene dos residuos de tirosina conservados; un dominio de proteína tirosina quinasa; un motivo α estéril (SAM) y un motivo de unión al dominio PDZ. EphB4 interactúa con el ligando de unión a membrana Efrina B2 (Sakano, S. et al Oncogene. 1996 Aug 15; 13(4):813-22; Brambilla R. et al EMBO J. 1995 Jul 3;14(13):3116-26). EphB4, como otros miembros de la familia Eph, está activada por la unión de ligandos de efrina unidos a membrana agrupados (Davis S el al, Science. 1994 Nov 4;266(5186):816-9), lo que indica que el contacto entre las células que expresan el receptor y las células que expresan el ligando es necesario para la activación del receptor de Eph. Tras la unión con el ligando, un receptor de EphB4 se dimeriza y autofosforila los residuos de tirosina de yuxtamembrana para lograr la activación completa.

Se ha considerado generalmente que cuando una célula que expresa EphB4 encuentra una célula que expresa EfrinaB2, la interacción de EphB4-EfrinaB2 y la agregación desencadena la señalización en ambas células.

La señalización de EphB4-EfrinaB2 se ha implicado en la angiogénesis (Wang et al. Cell. 1998 May 29; 93(5):741-53; Gerety et al. Mol Cell. 1999 Sep;4(3): 403-14). La angiogénesis, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos del endotelio de una vasculatura preexistente, es un proceso crítico en el crecimiento, progresión y metástasis de tumores sólidos dentro del huésped. Durante la angiogénesis fisiológicamente normal, las interacciones autocrinas, paracrinas, y anficrinas del endotelio vascular con sus componentes estromáticos circundantes son estrictamente reguladas tanto en forma espacial como temporal. En forma adicional, los niveles y actividades de las citoquinas proangiogénicas y angiostáticas y los factores de crecimiento se mantienen en equilibrio. En contraste, la angiogénesis patológica necesaria para el crecimiento del tumor activo es sostenida y persistente, lo que representa una desregulación del sistema angiogénico normal. Los tipos de tumor sólido y hematopoyético son particularmente asociados con un alto nivel de angiogénesis anormal.

En la técnica previa, WO 95/27061 desvelan anticuerpos que se unen a la porción extracelular de HpTK5 (EphB4). WO 2004/080425 y WO 2004/024773 son parte de la técnica previa de acuerdo con el artículo 54(3)EPC y desvelan la producción de los anticuerpos de unión a EphB4.

Se piensa generalmente que el desarrollo de un tumor consiste en etapas sucesivas e interrelacionadas que llevan a la generación de un clon autónomo con potencial crecimiento agresivo. Estas etapas incluyen el crecimiento sostenido y la auto-renovación no limitada. Las poblaciones celulares en un tumor se caracterizan generalmente por autosuficiencia de la señal de crecimiento, disminución de la sensibilidad para las señales supresoras del crecimiento y resistencia a la apoptosis. Los eventos genéticos o citogenéticos que inician el crecimiento aberrante sostienen las células en un estado "listo" prolongado al evitar la apoptosis.

Es un objetivo de la presente divulgación proporcionar agentes y tratamientos terapéuticos para inhibir la angiogénesis y el crecimiento tumoral.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a anticuerpos y las porciones de unión al antígeno de los mismos que se unen a y afectan a EphB4 de maneras particulares. Como se demuestra en a presente, EphB4 y EfrinaB2 participan en varios estados de enfermedad, que incluyen cánceres y enfermedades relacionadas con la angiogénesis no deseada o excesiva. Por consiguiente, los anticuerpos y las porciones de unión al antígeno de los mismos desvelados en la presente se pueden usar para tratar tales enfermedades. Además, se ha hallado que EphB4 y/o EfrinaB2 se expresan, a menudo en niveles altos, en una variedad de tumores. En consecuencia, los anticuerpos y las porciones de unión al antígeno de los mismos que regulan por disminución la función de EphB4 o EfrinaB2 pueden afectar los tumores por un efecto directo sobre las células tumorales así como un efecto indirecto sobre los procesos angiogénicos reclutados por el tumor. Se puede proporcionar la identidad de los tipos tumorales particularmente adecuados para el tratamiento con un agente que regula por disminución la función de EphB4 o EfrinaB2.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo que se une a un epitope situado dentro de los aminoácidos 16-198 de la secuencia de EphB4 de la Figura 1, que inhibe la interacción entre EphB4 y Efrina B2, y que promueve la apoptosis en una célula tumoral.

Por ejemplo, el epitope se puede situar dentro del dominio globular (GD) de EphB4 que se une a EfrinaB2. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo pueden inhibir la unión de EphB4 a la porción extracelular de EfrinaB2.

El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo pueden inhibir la dimerización o multimerización de EphB4 y opcionalmente puede inhibir la autofosforilación de EphB4 estimulada por EfrinaB2. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo puede inhibir la formación de tubos por las células endoteliales cultivadas, la vascularización de un tejido in vivo, la vascularización del tejido implantado en la córnea de un animal, la vascularización de un tapón de tejido de Matrigel implantado en un animal, y/o el crecimiento de un xenoinjerto de tumor humano en un ratón. Los anticuerpos preferidos que se unen a un epitope situado dentro de los aminoácidos 16-198 de la secuencia de EphB4 de la Figura 1 incluyen los anticuerpos indicados en la presente como Núm. 001, Núm. 023, Núm. 035, y Núm. 079.

La divulgación proporciona versiones humanizadas de cualquiera de los anticuerpos desvelados en la presente, así como los anticuerpos y las porciones de unión al antígeno de los mismos que comprenden al menos una porción de CDR derivada de un anticuerpo desvelado en la presente, en particular la CDR3. En las realizaciones preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que es inmunocompatible con el individuo al que se va a administrar, y preferentemente es clínicamente aceptable para la administración a un ser humano.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona un hibridoma que produce un anticuerpo desvelado en la presente, y en particular un hibridoma que produces un anticuerpo indicado en la presente como Núm. 023.

Los hibridomas que producen el anticuerpo Núm. 023 (epitope dentro de los aminoácidos 16198), anticuerpo Núm. 091 (anticuerpo de activación de quinasa; epitope dentro de los aminoácidos 324429), anticuerpo Núm. 098 (epitope dentro de los aminoácidos 430-537), anticuerpo Núm. 131 (epitope dentro de los aminoácidos 324-429), y anticuerpo Núm. 138 (epitope dentro de los aminoácidos 430-537) se depositaron en el American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. La designación del depósito de ATCC Números para el anticuerpo Núm. 023, Núm. 091, Núm. 098, Núm. 131, y Núm. 138 son PTA- 6208, PTA-6209, PTA-6210, PTA-6214, y PTA-6211, respectivamente.

En consecuencia, ciertos aspectos específicos de la invención proporcionan una célula del hibridoma que tiene designación del depósito de ATCC Núm. PTA-6208.

De modo sorprendente, los anticuerpos que inhiben la unión al ligando, los anticuerpos que inhiben la activación de la EphB4 quinasa y los anticuerpos que activan la actividad de quinasa de EphB4 inhiben los eventos mediados por EphB4 en los bioensayos. Por consiguiente, la presente invención proporciona el anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la invención... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo que se une a un epitope situado dentro de los aminoácidos 16-198 de la secuencia de EphB4 de la Figura 1, que inhibe la interacción entre EphB4 y Efrina B2, y que promueve la apoptosis en una célula tumoral.

2. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1, que inhibe la unión de EphB4 a la porción extracelular de EfrinaB2.

3. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de cualquier reivindicación precedente, que inhibe la formación de dímeros o multímeros de EphB4

4. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de cualquier reivindicación precedente, que inhibe la autofosforilación estimulada por EfrinaB2 de EphB4.

5. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de cualquier reivindicación precedente, que inhibe la formación de tubos por las células endoteliales cultivadas, inhibe la vascularización de un tejido in vivo, inhibe la vascularización del tejido implantado en la córnea de un animal, inhibe la vascularización de un tapón de tejido de Matrigel implantado en un animal, y/o disminuye el crecimiento de un xenoinjerto tumoral humano en un ratón.

6. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de cualquier reivindicación precedente, que es un anticuerpo humanizado.

7. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de cualquier reivindicación precedente, que comprende al menos una porción de CDR derivada del anticuerpo 023 expresada por una célula huésped que tiene la designación de depósito de ATCC Núm. PTA-6208.

8. El anticuerpo de cualquier reivindicación precedente, que es un anticuerpo monoclonal.

9. El anticuerpo de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo monoclonal es clínicamente aceptable para la administración a un ser humano.

10. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de cualquier reivindicación precedente, que está unida de modo covalente a un resto funcional adicional.

11. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 10, en el que el resto funcional adicional es una marca.

12. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 11, en el que la marca es adecuada para la detección por un procedimiento seleccionado del grupo que consiste: procedimientos de detección por fluorescencia, procedimientos de detección por tomografía de emisión de positrones y procedimientos de detección por resonancia magnética nuclear.

13. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 12, en el que la marca se selecciona del grupo que consiste en una marca fluorescente, una marca radiactiva y una marca que tiene una característica de resonancia magnética nuclear distintiva.

14. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 10, en el que el resto funcional adicional confiere aumento de la vida media sérica del anticuerpo o la porción de unión al antígeno del mismo.

15. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 14, en el que el resto funcional adicional comprende un resto de polietilenglicol (PEG).

16. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo es expresado por una célula huésped que tiene designación del depósito de ATCC Núm. PTA-6208.

17. Una preparación farmacéutica que comprende el anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de cualquier reivindicación precedente.

18. Un anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para usar en medicina.

19. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 18 para usar en el tratamiento del cáncer de un paciente.

20. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 19, en el que el paciente está diagnosticado con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en carcinoma de colon, tumor de mama, mesotelioma, tumor de próstata, carcinoma de células escamosas, sarcoma de

Kaposi, y leucemia.

21. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 19 o reivindicación 20, en el que el anticuerpo aislado o una porción de unión al antígeno del mismo es para la administración sistémica.

5 22. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 19 o reivindicación 20, en el que el anticuerpo aislado es para administración local.

23. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 18 para usar en la inhibición de la angiogénesis en un paciente.

24. El anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 23, en 10 el que el paciente está diagnosticado con degeneración macular.

25. El uso de un anticuerpo aislado o la porción de unión al antígeno del mismo que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para la fabricación de un medicamento para tratar cáncer en un paciente o tratar la angiogénesis en un paciente.

26. El uso que se reivindica en la reivindicación 25, modificado por las características de 15 cualquiera de las reivindicaciones 20-22 y 24.

27. Un hibridoma que produce un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

28. El hibridoma de la reivindicación 27, que tiene designación de depósito de ATCC Núm. PTA6208.