ANTICUERPOS CONTRA UN EPÍTOPE DE AGR2, ENSAYOS E HIBRIDOMAS.

Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo,

que se une específicamente a un epítope dentro de la secuencia KPGAKKDTKDSRPKL (Secuencia ID Nº: 2) de AGR2

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales y a fragmentos de unión a antígeno de dichos anticuerpos monoclonales. La invención también se refiere a hibridomas capaces de producir dichos anticuerpos. Otros aspectos de la invención también se refieren a usos de los anticuerpos monoclonales descritos en ensayos de diagnóstico y pronóstico para la enfermedad metastásica.

La proteína 2 de gradiente anterior (AGR2) es el homólogo humano del gen específico de glándula de cemento de Xenopous (XAG-2). La secuencia de aminoácidos de AGR2 se muestra en la Secuencia ID Nº: 1. Se ha mostrado que una expresión aumentada de AGR2 se correlaciona con la positividad para receptores de estrógenos (ER) en muestras de carcinoma de mama. La expresión inducida de AGR2 parece provocar un fenotipo metastásico en células no metastásicas por lo demás benignas.

El cáncer es la segunda causa más común de muerte en el mundo occidental y es la causa principal de muerte entre las personas de menos de 85 años de edad. Una de cada cuatro personas de la población morirá de cáncer, y estas muertes generalmente se producen como resultado de la enfermedad metastásica intratable. La diseminación de metástasis por todo el cuerpo aumenta el número de tejidos dañados por cáncer, mientras que simultáneamente hace que el tratamiento del cáncer sea cada vez más difícil. El número de metástasis que pueden desarrollarse a partir de un solo tumor primario generalmente será demasiado grande para tratarse, y el número de sitios diferentes que requieren tratamiento demasiado numeroso y variado.

La capacidad de los cánceres metastásicos de “reaparecer” o “aparecer”, incluso después de la escisión o resolución de un tumor primario y un tratamiento sistémico, contribuye en gran medida a las dificultades experimentadas en el tratamiento del cáncer y también a la angustia sufrida por los pacientes con cáncer que no están seguros de si el tratamiento ha sido eficaz o no para liberarlos del cáncer.

A la luz de la grave influencia del cáncer en la población como conjunto, se apreciará que existe una necesidad bien reconocida de procedimientos que puedan usarse para diagnosticar el cáncer metastásico (enfermedad metastásica). Muchos procedimientos existentes carecen de sensibilidad y/o fiabilidad y, por lo tanto, los resultados de estos procedimientos no pueden considerarse concluyentes. Una sensibilidad reducida de ensayos de diagnóstico puede llevar a diagnósticos incorrectos que se hacen basándose en resultados de ensayo incorrectos.

También existe la necesidad de ensayos que puedan usarse como pronóstico para evaluar la probabilidad de un paciente de desarrollar cáncer metastásico. Las limitaciones de sensibilidad y fiabilidad de los ensayos existentes para la enfermedad metastásica también significan que ciertos pacientes con un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad metastásica no se identifican necesariamente usando los ensayos existentes. La incapacidad de identificar a dichos pacientes puede significar que se pierden las oportunidades de intervención terapéutica antes de la aparición de los síntomas de la enfermedad metastásica.

También existe la necesidad de ensayos de pronóstico que puedan indicar si un paciente responderá o no de forma favorable al tratamiento para un cáncer metastásico. En general, los tratamientos para el cáncer metastásico comprenden regímenes relativamente “severos”. Dichos regímenes de tratamiento, y los efectos adversos que pueden producir, generalmente se justifican en el caso de pacientes que es de esperar que no respondan a un tratamiento menos riguroso. Sin embargo, generalmente se preferirá evitar someter a los pacientes con probabilidad de responder favorablemente a un tratamiento más “suave” a regímenes severos innecesarios. Fletcher y col. (2003) desvela un anticuerpo policlonal contra una combinación de dos péptidos que representan dos fragmentos adyacentes de hAG-2 con una homología mínima a otros miembros de la familia conocidos.

Es un objeto de ciertas realizaciones de la invención solucionar o aliviar los problemas asociados con la técnica anterior. Por ejemplo, es un objeto de ciertas realizaciones de la presente invención proporcionar ensayos de diagnóstico para la enfermedad metastásica que sean más sensibles que los proporcionados por la técnica anterior. Es un objeto de ciertas realizaciones de la presente invención proporcionar ensayos de diagnóstico para la enfermedad metastásica que sean más fiables que los proporcionados por la técnica anterior. Es un objeto de ciertas realizaciones de la invención proporcionar ensayos de diagnóstico para la enfermedad metastásica que sean más sensibles que los proporcionados por la técnica anterior. Es un objeto de ciertas realizaciones de la invención proporcionar ensayos de pronóstico para la enfermedad metastásica que sean más fiables que los proporcionados por la técnica anterior. Es un objeto de ciertas realizaciones de la invención proporcionar agentes que puedan usarse en ensayo de diagnóstico y/o pronóstico para la enfermedad metastásica que tengan mayor sensibilidad y/o fiabilidad que los proporcionados por la técnica anterior.

En un primer aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítope dentro de la secuencia KPGAKKDTKDSRPKL (Secuencia ID Nº: 2) de AGR2.

La secuencia ID Nº: 2 corresponde a los 26-40 restos aminoacídicos de AGR2 humana. Los inventores han descubierto que un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene la especificidad definida anteriormente proporciona notables ventajas en su uso en comparación con anticuerpos de la técnica anterior contra AGR2. En particular, los anticuerpos de la invención pueden usarse en ensayos de pronóstico o diagnóstico para el cáncer y, particularmente, para la enfermedad metastásica, que tienen mayor sensibilidad que ensayos similares proporcionados por la técnica anterior. Aunque la expresión de AGR2 está fuertemente asociada con cánceres mamarios, la expresión de este marcador también está presente en una amplia serie de cánceres que incluyen carcinoma esofágico de células escamosas, carcinoma pancreático y carcinomas de próstata. Por consiguiente, los inventores creen que los anticuerpos y procedimientos de la invención pueden usarse en relación con el cáncer, y la enfermedad metastásica, asociados con cualquier forma de cáncer primario.

Los “anticuerpos de la invención”, como se menciona en la presente divulgación, pueden ser cualquier anticuerpo monoclonal que tenga especificidad por un epítope dentro de la secuencia KPGAKKDTKDSRPKL (Secuencia ID Nº: 2) de AGR2. El anticuerpo producido por el hibridoma PZ7A10F10 representa un ejemplo particularmente preferido de un anticuerpo de la invención. PZ7A10F10 se depositó a tenor del Tratado de Budapest en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), en Porton Down, Salisbury, el 22 de agosto de 2006, y se le dio el Número de Registro 06082201. El anticuerpo monoclonal producido por este hibridoma, para los fines de la presente divulgación, puede denominarse “antiAGR2/PZ7A10F10”. Anti-AGR2/PZ7A10F10, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, representa un anticuerpo preferido, o fragmentos de unión a antígeno preferidos, para su uso en todos los aspectos y realizaciones de la invención. AGR2/PZ7A10F10 es una IgG, anticuerpo de cadena ligera κ.

Como se usa en la presente divulgación, debe considerarse que el término anticuerpo de la invención, a menos que el contexto exija otra cosa, comprende fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos de la invención, así como derivados de unión a antígeno de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo.

Cualquier fragmento de unión a antígeno adecuado de los anticuerpos de la invención puede prepararse de acuerdo con técnicas conocidas por los expertos en la materia. Los fragmentos de unión a antígeno funcionales más pequeños de los anticuerpos de la invención pueden comprender las regiones variables de las cadenas pesada (VH) o ligera (VL) de dichos anticuerpos. Estos fragmentos pueden tener un peso molecular de aproximadamente 13 kDa,

o menos de un décimo el tamaño típico de un anticuerpo completo.

Pueden expresarse bien fragmentos de unión a antígeno de este tipo en sistemas de células bacterianas, de levadura y de mamífero. Dichos fragmentos también...

1. Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítope dentro de la secuencia KPGAKKDTKDSRPKL (Secuencia ID Nº: 2) de AGR2.

2. Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, que no se une a AGR3; y/o que se une al mismo antígeno que el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma PZ7A10F10 depositado a tenor del Tratado de Budapest y al que se le ha asignado el número de acceso 06082201.

3. Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o fragmento se marca con un resto indicador seleccionado entre el grupo que consiste en: un resto luminiscente; un resto bioluminiscente; un material radiactivo; un grupo prostético; un resto colorimétrico; una nanopartícula detectable; un resto cromogénico; y un resto fluorescente, que puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: isotiocianato de fluoresceína (FITC); rodamina (TRITC); ficoeritrina; aloficocianina; cumarina (AMCA); rojo Texas; cianina (Cy2), cianina (Cy3); y cianina (Cy5).

4. Un procedimiento in vitro para diagnosticar cáncer usando un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítope dentro de la secuencia KPGAKKDTKDSRPKL (Secuencia ID Nº: 2).

5. Un procedimiento para diagnosticar cáncer de acuerdo con la reivindicación 4,

comprendiendo el procedimiento: poner en contacto una muestra de un paciente con un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítope dentro de la secuencia KPGAKKDTKDSRPKL (Secuencia ID Nº: 2); y ensayar la unión del anticuerpo a la muestra del paciente, en el que la unión del anticuerpo a la muestra del paciente es predictiva de enfermedad metastásica en el paciente.

6. Un procedimiento in vitro para evaluar la probabilidad de desarrollar cáncer usando un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un

epítope dentro de la secuencia KPGAKKDTKDSRPKL (Secuencia ID Nº: 2).

7. Un procedimiento para evaluar la probabilidad de desarrollar cáncer de acuerdo con la reivindicación 6, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto una muestra de un paciente con un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítope dentro de la secuencia KPGAKKDTKDSRPKL (Secuencia ID Nº: 2); y ensayar la unión del anticuerpo a la muestra del paciente, en el que la unión del anticuerpo a la muestra del paciente indica que el paciente tiene una probabilidad elevada de desarrollar enfermedad metastásica.

8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el cáncer es un cáncer metastásico.

9. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que el ensayo de la unión del anticuerpo a la muestra del paciente utiliza una técnica seleccionada entre el grupo que consiste en: marcado inmunocitoquímico de una muestra de tejido; un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA); inmunoensayo de quimioluminiscencia; inmunoensayo de fluorescencia; y separación de células activadas por fluorescencia (FACS).

10. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en el

que: i) la muestra del paciente comprende células tumorales, y el ensayo comprende ensayar la unión del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, a células tumorales en la muestra del paciente; y/o ii) la muestra del paciente se selecciona entre el grupo que consiste en: una muestra de sangre; una muestra de biopsia; una muestra de histología; y una muestra de criotomía; y/o el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, usado es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Un kit que comprende un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítope dentro de la secuencia KPGAKKDTKDSRPKL (Secuencia ID Nº: 2).

12. Un kit de acuerdo con la reivindicación 11 que comprende un anticuerpo monoclonal, o

fragmento de unión a antígeno del mismo, producido por el hibridoma PZ7A10F10 depositado a tenor del Tratado de Budapest y que recibió el número de acceso 06082201; y/o al menos un artículo seleccionado del grupo que consiste en: materiales de instrucción para usar el kit; reactivos para uso en la detección en la unión del anticuerpo; reactivos para uso en la

5 incubación de anticuerpo; y reactivos para la visualización de núcleos celulares.

13. Un soporte sólido que comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítope dentro de la secuencia KPGAKKDTKDSRPKL (Secuencia ID Nº: 2) inmovilizado en el mismo.

14. Un soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, producido por el hibridoma PZ7A10F10 depositado a tenor del Tratado de Budapest y que recibió el número de acceso 06082201; y/o en el que el soporte sólido es una matriz.

15. Un hibridoma PZ7A10F10 depositado a tenor del Tratado de Budapest y que recibió el número de acceso 06082201.

16. Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une

20 específicamente a un epítope dentro de la secuencia KPGAKKDTKDSRPKL (Secuencia ID Nº: 2) de AGR2 para uso como un medicamento.

17. Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo

con la reivindicación 16, para uso como un medicamento en la prevención y/o tratamiento de 25 cáncer y/o una enfermedad inflamatoria.