Anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína recombinante del mismo,

que es específico para YKL-40 humana (SEQ ID NO: 1), pudiendo dicho anticuerpo, fragmento de unión o proteína recombinante del mismo inhibir el crecimiento de una célula tras su unión a un epítopo en YKL-40, siendo la célula una célula cancerosa que expresa YKL-40

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-YKL-40 humana monoclonales, que pueden inhibir el crecimiento y/o inducir apoptosis de células, en particular células cancerosas, a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos y a usos de dichos anticuerpos y/o composiciones farmacéuticas para el tratamiento de una enfermedad en la que la inhibición del crecimiento celular, la diferenciación celular, la remodelación de la matriz extracelular, la metástasis y/o la inducción de muerte celular debida a apoptosis es un requisito previo para un curado satisfactorio.

Antecedentes de la invención

YKL-40 se identificó por primera vez como una proteína secretada en grandes cantidades por una línea celular de osteosarcoma humana, MG63, in vitro y se denominó según los últimos tres aminoácidos N-terminales de su secuencia de aminoácidos, Tyr (Y), Lys (K) y Leu (L), y un peso molecular aproximado de 40 kDa (Johansen et al., 1992).

El análisis de la secuencia de aminoácidos de YKL-40 reveló que la proteína pertenece a la familia de la glicosil hidrolasa 18 (Hakala et al., 1993). La familia consiste en enzimas incluyendo quitinasas y también proteínas, que no tienen actividad enzimática. El gen de YKL-40 (CHI3L1) está ubicado en el cromosoma 1q31-1q32 y consiste en 10 exones y abarca aproximadamente 8 kilobases de ADN genómico (Rehli et al., 1997). Los factores de transcripción de la familia Sp1 parecen tener un papel predominante en el control de la actividad del promotor de YKL-40 (Rehli et al., 2003). Se ha descrito la estructura cristalográfica de YKL-40 humana (Fusetti et al., 2003; Houston et al., 2003). La proteína contiene dos dominios globulares: un dominio central grande que consiste en una estructura de dominio (/)8 con un pliegue de barril de triosa-fosfato isomerasa (TIM), y un dominio / pequeño, compuesto por cinco cadenas beta antiparalelas y una hélice , insertada en el bucle entre la cadena 7 y la hélice 7. Esto confiere al sitio activo de YKL-40 un carácter similar a una hendidura. La estructura de YKL-40 es en parte similar a la estructura de varias proteínas, por ejemplo quitotriosidasa humana (Fusetti et al., 2002), Ym1 de ratón (Sun et al., 2001), factor de crecimiento 2 de discos imaginales de Drosophila melanogaster (Varela et al., 2002) y algunos otros miembros de la familia de la glicosil hidrolasa 18 (Coulson, 1994), aunque hay también diferencias importantes. Una de estas diferencias es una mutación de uno de los tres aminoácidos (Asp, Glu y Asp) esenciales para la actividad catalítica de tipo quitinasa, concretamente Glu -> Leu, que descarta completamente la función de YKL-40 como enzima glicolítica. YKL-40 puede unirse a quitina, pero no tiene actividad enzimática (Renkema et al., 1998). YKL-40 es una glicoproteína y esto también es una característica única de YKL-40 en comparación con las otras proteínas similares a quitinasa de mamífero.

YKL-40 puede unirse a heparina. La secuencia de aminoácidos de la proteína contiene un motivo de unión a heparina (143GRRDKQH149) que está ubicado en un bucle superficial (Fusetti et al., 2003). YKL-40 también puede unirse a hialuronano. La proteína plegada contiene dos posibles sitios de unión a hialuronano en la cara externa. YKL-40 humana puede unirse a quitina de diferentes longitudes de una manera similar que quitinasas de la familia

18. Se identificaron nueve subsitios de unión a azúcar en la hendidura de 43 Å de YKL-40 (Fusetti et al., 2003). También es posible la unión de oligosacáridos cortos o largos a YKL-40 humana. La presencia de dos sitios de unión diferenciados con afinidad selectiva por oligosacáridos largos y cortos (no encontrados en otras proteínas similares a quitinasa de mamífero) puede tener significación para la actividad funcional de YKL-40 como reticulante entre dos dianas que portan estos oligosacáridos.

YKL-40 posee varias actividades biológicas. Así, se ha mostrado que YKL-40 humana puede actuar como factor de crecimiento para células de tejido conjuntivo, tales como condrocitos y células sinoviales (De Ceuninck et al., 2001; Recklies et al., 2002). YKL-40 también promueve el crecimiento de fibroblastos de una manera similar al factor de crecimiento 1 similar insulina (IGF-1) (Recklies et al., 2002). En fibroblastos, YKL-40 inicia la activación de cascadas de señalización de MAP cinasa y PI3K que conducen a la fosforilación tanto de la cinasa regulada por señales extracelulares (ERK)-MAP cinasa 1/2 como la proteína cinasa B (AKT). Se ha sugerido que la activación de rutas de transducción de señales citoplasmáticas por YKL-40 está mediada a través de la interacción de YKL-40 con una o más moléculas receptoras en la membrana plasmática, aunque la identidad del receptor celular que media los efectos biológicos de YKL-40 se desconoce actualmente.

También se ha demostrado que YKL-40 actúa como quimioatrayente para células endoteliales y estimula la migración de estas células de manera comparable a la estimulación por el factor de crecimiento de fibroblastos básico (Malinda et al., 1999).

YKL-40 modula la morfología de células endoteliales vasculares promoviendo la formación de túbulos de ramificación, lo que indica que YKL-40 puede desempeñar un papel en la angiogénesis estimulando la migración y reorganización de células endoteliales vasculares (Malinda et al., 1999). YKL-40 es también un factor de migración y adhesión para células de músculo liso vascular (Nishikawa et al., 2003). Se ha sugerido que YKL-40 puede afectar a las concentraciones de hialuronano extracelular locales disponibles para la unión celular por medio de dos mecanismos independientes: uniéndose al hialuronano extracelular e interfiriendo con la síntesis y secreción de hialuronano por las células. Por tanto, YKL-40 puede influir en el grado de migración y adhesión celular durante los procesos de remodelación tisular que tienen lugar durante la inflamación, fibrosis, aterogénesis y crecimiento del cáncer y metástasis del cáncer.

En ratones, YKL-40 se denominó “proteína de regresión mamaria (Brp-39)” porque la expresión de la proteína se indujo en células epiteliales mamarias unos cuantos días tras el destete. Se propuso (Mohanty et al., 2003) que YKL40 está implicada en la regulación de la muerte celular programada durante la involución mamaria como factor de señalización protector que determina qué células van a sobrevivir a la remodelación tisular drástica que se produce durante la involución.

YKL-40 se expresa por diferentes tipos de células in vitro e in vivo, en particular en tejidos caracterizados por inflamación, degradación/remodelación de la matriz extracelular o fibrogénesis en curso. YKL-40 se secreta por neutrófilos activados (Volck et al., 1998), por macrófagos durante el estado tardío de diferenciación (Kirckpatrick et al., 1997; Krause et al. 1996; Rehli et al., 1997; Renkema et al., 1998; Rehli et al., 2003), condrocitos artríticos (Hakala et al., 1993; Johansen et al. 2001; Volck et al. 2001), células de músculo liso vascular diferenciadas (Shackelton et al., 1995; Malinda et al., 1999; Nishikawa et al. 2003) y células sinoviales similares a fibroblastos (Hakala et al. 1993; Nyirkos et al., 1990; Dasuri et al., 2004). Estudios en condrocitos fetales humanos indican que YKL-40 es un marcador de diferenciación (Imabayashi et al., 2003). In vivo, se encuentra expresión de ARNm y proteínas de YKL-40 en una subpoblación de macrófagos en membrana sinovial inflamada (Kirkpatrick et al., 1997; Baeten et al., 2000; Volck et al., 2001), placas ateromatosas (Boot et al. 1999), vasos con arteritis de pacientes con arteritis de células gigantes (Johansen et al., 1999a) y por condrocitos artríticos (Volck et al., 2001), y macrófagos peritumorales en biopsias de cáncer de pulmón de células pequeñas que expresan ARNm de YKL-40 (Junker et al., 2005b).

Se ha mostrado que una fuerte expresión de ARNm de YKL-40 en hígado humano está asociada con la presencia de fibrosis: Estudios inmunohistoquímicos de biopsias hepáticas han mostrado la expresión de la proteína YKL-40 en zonas del hígado con fibrosis, mientras que no se observó expresión en hepatocitos (Johansen et al., 1997; Johansen et al. 2000). El análisis de hibridación sustractiva por supresión y la RT-PCR han demostrado que YKL-40 es una de las proteínas más sobreexpresadas en tejido hepático cirrótico provocado por el virus de la hepatitis C (VHC) (Shackel et al., 2003).

Los pacientes... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína recombinante del mismo, que es específico para YKL-40 humana (SEQ ID NO: 1), pudiendo dicho anticuerpo, fragmento de unión o proteína recombinante del mismo inhibir el crecimiento de una célula tras su unión a un epítopo en YKL-40, siendo la célula una célula cancerosa que expresa YKL-40.

2. Anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína recombinante del mismo, según la reivindicación 1, pudiendo dicho anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína recombinante reconocer específicamente y unirse a un epítopo que comprende los restos 210-220 de SEQ ID NO: 1.

3. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, siendo el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

4. Anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína recombinante del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula es una célula cancerosa y la célula cancerosa es de cualquier cáncer primario o metastásico seleccionado de carcinoma de mama, colorrectal, de páncreas, de estómago, hepatocelular, otros carcinomas gastrointestinales, de pulmón, de pulmón de células pequeñas, de ovarios, de útero, de cuello uterino, de testículos, de próstata, de vejiga, renal, de tiroides y de cabeza/cuello, melanoma maligno, otros cánceres cutáneos, osteosarcoma, condrosarcoma, miosarcoma, glioblastoma u otros tumores cerebrales, tumores de células germinales y tumores malignos hematopoyéticos.

5. Fragmento peptídico que consiste en la secuencia GAWRGTTGHHS (SEQ ID NO: 5).

6. Uso in vitro de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína recombinante del mismo según se definen dicho anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína recombinante del mismo en las reivindicaciones 1 a 4 para inhibir el crecimiento celular, la diferenciación y/o la supervivencia celular.

7. Medicamento que comprende el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína recombinante del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la prevención de la progresión y/o el tratamiento de un estado patológico seleccionado del grupo que consiste en cáncer, enfermedad inflamatoria y fibrosis.

8. Medicamento según la reivindicación 7, en el que el estado patológico se selecciona de un cáncer sólido, tumor maligno hematológico y enfermedad inflamatoria.

9. Medicamento según la reivindicación 7, en el que el cáncer es un cáncer primario o cáncer metastásico seleccionado de cualquier cáncer primario o cáncer metastásico seleccionado de carcinoma de mama, colorrectal, de páncreas, de estómago, hepatocelular, otros carcinomas gastrointestinales, de pulmón, de pulmón de células pequeñas, de ovarios, de útero, de cuello uterino, de testículos, de próstata, de vejiga, renal, de tiroides y de cabeza/cuello, melanoma maligno, otros cánceres cutáneos, osteosarcoma, condrosarcoma, miosarcoma, glioblastoma u otros tumores cerebrales, tumores de células germinales y tumores malignos hematopoyéticos.

10. Medicamento según la reivindicación 7, en el que la enfermedad inflamatoria se selecciona de artritis reumatoide, infección bacteriana, enfermedad inflamatoria del intestino activa, enfermedades inflamatorias, fibrosis hepática, fibrosis de órganos, fibrosis tisular y fibrosis cutánea.

11. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína recombinante del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.