Un anticuerpo monoclonal contra un monómero de fibrina, en el que el anticuerpo reconoce específicamente un sitio con cambio conformacional recién producido en una región en C-terminal de una cadena Aα

del monómero de fibrina formado mediante digestión con trombina de un fibrinógeno, pero que no reacciona con fibrinógeno, productos de degradación con plasmina del monómero de fibrina o productos de degradación con plasmina de la fibrina reticulada, en el que el sitio reconocido por el anticuerpo es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los residuos de aminoácidos de 502 a 521 de la cadena Aα del fibrinógeno.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal contra una fibrina soluble que no reacciona con fibrinógeno, pero que reconoce específicamente un sitio con cambio conformacional recién producido en una región C terminal de una cadena Aα de la fibrina soluble formada mediante la digestión con trombina del fibrinógeno. El anticuerpo monoclonal detecta específicamente la fibrina soluble sin detectar una fibrina soluble digerida con plasmina o productos de la degradación de fibrina reticulada porque el sitio con cambio conformacional reconocido por el anticuerpo monoclonal es escindido de la fibrina soluble mediante digestión con plasmina y, por tanto, el anticuerpo monoclonal pierde su reactividad con la fibrina soluble digerida con plasmina. La presente invención también se refiere a un ensayo inmunológico empleando el anticuerpo monoclonal. La presente invención se refiere además a un procedimiento para evaluar la hipercoagulabilidad en una muestra de ensayo midiendo los niveles de la fibrina soluble en la muestra con el procedimiento de ensayo inmunológico.

Técnica anterior

La detección de un marcador molecular formado en la sangre en respuesta a la activación del sistema coagulaciónfibrinolítico es un factor importante para el diagnóstico precoz del síndrome de coagulación intravascular diseminada (CID), así como para comprobar el estado de la misma. Particularmente, el complejo de monómeros de fibrina soluble (CMFS) se ha empleado clínicamente como marcador para detectar hipercoagulabilidad inicial. La trombina, que se ha formado mediante activación en un vaso sanguíneo, corta el extremo N de una cadena Aα de fibrinógeno para formar, de este modo, un monómero de desAA fibrina y, además, corta el extremo N de la cadena Bβ del mismo para formar, de este modo, un monómero de desAABB fibrina. El monómero de fibrina formado de este modo forma un complejo con fibrinógeno u otros en la sangre u el complejo (es decir, CMFS) circula en sangre. Como se conoce, la trombogénesis se puede detectar en un estadio precoz mediante la detección del CMFS.

Hasta la fecha se han notificado varios anticuerpos específicos y procedimientos de ensayo inmunológico para detectar el CMFS. Por ejemplo, G. Soe y col. han dado a conocer un anticuerpo IF-43 como anticuerpo monoclonal que reconoce un cambio de conformación que se produce en el dominio E durante la formación de un complejo fibrina-fibrinógeno a partir de un monómero de fibrina y fibrinógeno. El epítopo reconocido por el anticuerpo IF-43 está presente en una secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 17 a 78 en la región N-terminal de la cadena Aα. El anticuerpo IF-43 se caracteriza porque no actúa sobre el fibrinógeno, el monómero de fibrina o los productos de la degradación con plasmina del fibrinógeno o los productos de la degradación con plasmina de la fibrina, por lo que refleja el sistema de coagulación sanguínea (documento de patente 1 y documento que no es patente 1).

No obstante, se sabe que un reactivo de ensayo de fibrina soluble que emplea el anticuerpo IF-43 (Iatro FS, Patrón) actúa sobre un complejo formado a través de la reacción entre monómero de fibrina-productos de la degradación con plasmina (fragmento de fibrina X, Y o E) y fibrinógeno, así como sobre el complejo formado a través de la reacción entre monómero de fibrina-productos de la degradación con plasmina y fibrinógeno-productos de degradación con plasmina (fragmento X, Y o D) (documento de patente 2). Por tanto, ya que el anticuerpo IF-43 también actúa sobre la fibrina soluble digerida con plasmina, el anticuerpo no se puede considerar un anticuerpo que refleje exclusivamente el sistema de coagulación.

Asimismo, se ha dado a conocer un anticuerpo que reconoce una secuencia de aminoácidos en la región N-terminal de la cadena Aα de fibrinógeno que se forma cortando la cadena Aα con trombina. Específicamente, U. SCHEEFERS-BORCHEL y col. produjeron anteriormente un anticuerpo específico de la fibrina soluble mediante inmunización con un hexapéptido sintético (GPRVVE) que es idéntico a la secuencia de aminoácidos de la región N-terminal de la fibrina (documento no patente 2). A. Hamano y col. produjeron anteriormente un anticuerpo (F405) específico de la fibrina soluble usando un monómero de fibrina preparado tratando fibrinógeno con batroxobina, como inmunógeno (documento de patente 3 y documento no patente 3).

No obstante, dado que el epítopo reconocido por estos anticuerpos es un sitio en la secuencia de aminoácidos en NTERMINAL que se forma mediante una acción de la trombina sobre la cadena Aα, se considera que estos anticuerpos actúan sobre los productos de la degradación con plasmina del monómero de fibrina, complejos de los mismos y fracciones XDP (DY, DXD etc., productos de la degradación con plasmina de fibrina reticulada). Por tanto, se considera que estos anticuerpos no reflejan exclusivamente el sistema de coagulación, sino que reflejan los sistemas tanto de coagulación como fibrinolítico.

Además, se ha dado a conocer un anticuerpo monoclonal que reacciona con un péptido formado de la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 148 a 161 de una cadena Aα de fibrinógeno (documento patente 4).

Dado que el sitio de reconocimiento del anticuerpo no está en el lado C-terminal de la cadena Aα que se digiere con plasmina, se considera que el anticuerpo reacciona con fibrina soluble digerida con plasmina o los productos de la degradación con plasmina de la fibrina reticulada. Por tanto, el anticuerpo no se puede considerar como un anticuerpo que refleja exclusivamente el sistema de coagulación.

Mitkevich y col., BLOOD COAGULATION &F IBRINOLYSIS, ENE 1996, vol. 7, nº 1, páginas 85-92, describieron anticuerpos anti-fibrina, B10 y A11 de unión a epítopos lineales en la cadena Aalfa y no se unen al fibrinógeno, y 1 H10 y 5F3 no se unen a ninguna de las 3 cadenas del fibrinógeno sino al fragmento purificado E (tabla 1). B10 y A11 sufren reacciones cruzadas con el oligómero similar a X de fibrina. B10 y A11 están dirigidos al C terminal de la cadena Aalfa, un péptido de 6900 de peso molecular (D8, página 412, § 2). Se ha sugerido que el epítopo de B10 está entre los aminoácidos 78-103 de Aalfa.

Tymkewycz y col., BLOOD COAGULATION & FIBRINOLYSIS, ABR 1993, vol. 4, nº 2, páginas 211-221, divulgan un anticuerpo monoclonal (5A2) que se une a la región C terminal de la cadena Aalfa de la fibrina (529-539) que se une al fibrinógeno pero no a los fragmentos X, Y, D, E. El epítopo se destruye mediante la digestión con plasmina del fibrinógeno. Como se ha descrito anteriormente, en muchos casos, los anticuerpos convencionales contra una fibrina soluble formada mediante hipercoagulabilidad también reconocen una fibrina soluble digerida con plasmina o productos de degradación con plasmina de fibrina reticulada formada mediante el sistema fibrinolítico. Hasta la fecha no se conoce ningún anticuerpo que reconozca específicamente la fibrina soluble sobre la que no ha actuado la plasmina y no se ha dado a conocer ningún procedimiento que refleje exclusivamente el sistema de coagulación.

[Documento de patente 1] Publicación de patente internacional nº 95/012317 Folleto [Documento de patente 2] Solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público (kokai) Nº 2004-53359 [Documento de patente 3] Publicación de patente internacional nº 98/59047 Folleto [Documento de patente 4] Solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público (kokai) Nº 2-028197 [Documento que no es Patente 1] G. Soe., y col., Blood 88, 2109-2117, 1996. [Documento que no es Patente 2] U. SCHEEFERS-BORCHEL y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 7091-7095, 1985. [Documento que no es Patente 3] Hamano y col., Clinica Chimica Acta 318, 25-32, 2002.

Divulgación de la invención

Problemas que ha de resolver la invención

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal que refleje la hipercoagulabilidad inicial y que pueda medir específicamente la fibrina sobre la que no ha actuado la plasmina; un hibridoma que pueda producir el anticuerpo monoclonal; un procedimiento de ensayo inmunológico para medir la fibrina soluble empleando el anticuerpo monoclonal; y un procedimiento para evaluar la hipercoagulabilidad en una muestra de ensayo midiendo el nivel de fibrina soluble en la muestra con el procedimiento de ensayo inmunológico.

Medios para resolver los problemas

Los... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal contra un monómero de fibrina, en el que el anticuerpo reconoce específicamente un sitio con cambio conformacional recién producido en una región en C-terminal de una cadena Aα del monómero de fibrina formado mediante digestión con trombina de un fibrinógeno, pero que no reacciona con fibrinógeno, productos de degradación con plasmina del monómero de fibrina o productos de degradación con plasmina de la fibrina reticulada, en el que el sitio reconocido por el anticuerpo es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en los residuos de aminoácidos de 502 a 521 de la cadena Aα del fibrinógeno.

2. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sitio reconocido por el anticuerpo está presente en un fragmento en C terminal de una cadena Aα del fibrinógeno, en el que el fragmento se escinde del fibrinógeno cuando el fibrinógeno se transforma en fibrinógeno X mediante digestión con plasmina.

3. Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

4. Un procedimiento de ensayo inmunológico para medir un monómero de fibrina en una muestra de ensayo, que comprende hacer reaccionar el anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 con la muestra.

5. El procedimiento de ensayo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que se usa el anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 inmovilizado sobre un vehículo insoluble.

6. Un reactivo para un ensayo de medición de un monómero de fibrina, que comprende el anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

7. Un procedimiento para evaluar la hipercoagulabilidad en una muestra de ensayo, que comprende medir el nivel del monómero de fibrina en la muestra con el procedimiento de ensayo de acuerdo con la reivindicación 4 o 5.