Un método para someter a inmunoanálisis selectivamente un multímero de adiponectina diana seleccionado entreadiponectina peso molecular medio (Ad PMM) o adiponectina de peso molecular ultra bajo (Ad PMUB) en unamuestra biológica,

que comprende:

(1) para someter a inmunoanálisis selectivamente adiponectina de peso molecular medio (Ad PMM):

(a) hacer reaccionar una muestra con una proteasa que digiere específicamente Ad PMUB y LMW Ad;

(b) determinar la cantidad total de la adiponectina Ad PMM y Ad PMA no digerida que queda en la muestratratada en la etapa (a);

(c) determinar la cantidad de Ad PMA en la muestra biológica a través de la reacción de una proteasa con unamuestra que contiene adiponectina, mediante la cual se digiere la adiponectina distinta de Ad PMA, y analizarselectivamente la Ad PMA que permanece después de la digestión con la proteasa mediante el uso de unanticuerpo anti-adiponectina, y

(d) restar la cantidad de Ad PMA detectada en (c) de la cantidad total de adiponectina cuantificada en (b),donde la cantidad de Ad PMM corresponde a la cantidad cuantificada en (b) menos la cantidad de Ad PMAcuantificada en (c); o

(e) restar la cantidad total de Ad PMUB y Ad PMB convertidas, que se ha determinado en la etapa (a) de lacantidad total de Ad PMUB, Ad PMB y Ad PMM como la cantidad total de adiponectina convertida mediante eluso de una proteasa para determinar la cantidad de Ad PMA según la etapa (c);

(2) para someter a inmunoanálisis selectivamente adiponectina de peso molecular ultra bajo Ad PMUB, lacantidad de Ad PMUB contenida en una muestra se determina

a. tratando la Ad PMUB y la Ad PMB con la proteasa que digiere específicamente Ad PMUB y Ad PMB,

b. calculando la cantidad total de Ad PMA y Ad PMM que queda, y

c. restando de la cantidad total de Ad PMA y Ad PMM y la cantidad de Ad PMB de la cantidad total deadiponectina, que se ha determinado selectivamente, o

d. restando, de la cantidad total de adiponectina, la cantidad total de Ad PMB, Ad PMM y Ad PMA.

Método para analizar selectivamente multímeros de adiponectina

Campo técnico

La presente invención se refiere al análisis selectivo de formas multiméricas de adiponectina (denominadas en lo sucesivo multímeros de adiponectina) presentes en una muestra biológica.

Técnica Anterior

El documento WO 03/016906 describe un método de inmunoanálisis de Ad PMB en una muestra biológica. Waki et al., J. Biol.. Chem.. 278, 40352-40363 describen un método de uso de anticuerpos para detectar multímeros de adiponectina. La adiponectina es una hormona sensible a la insulina que es secretada específicamente por las células grasas, y está presente en la sangre a un nivel relativamente elevado (5 a 10 μg/mL) . Los autores de la presente invención han informado previamente sobre un efecto fisiológico de la adiponectina, esto es, la disminución del nivel de adiponectina es una causa de la diabetes tipo II después de la obesidad o una causa para el trastorno del metabolismo de los azúcares o lípidos en la diabetes lipoatrófica (Documento no de Patente 1) . Se han propuesto aplicaciones médicas de la adiponectina, incluyendo el diagnóstico de trastornos del metabolismo del azúcar; en particular, el seguimiento del efecto terapéutico de un derivado de tiazolidina que es un fármaco mejorador de la resistencia a la insulina (Documento de Patente 1) , y la dosificación de supresor fibrogenético hepático utilizando el efecto de adiponectina, incluyendo la supresión de la activación y el crecimiento de las células estrelladas y la supresión de la producción de matriz extracelular (Documento de Patente 2) .

La adiponectina se clasifica en la familia del C1q (Complemento 1q) sobre la base de su estructura, y por lo tanto tiene un dominio similar al colágeno, que es un rasgo característico de la familia C1q. Se ha informado de que la adiponectina forma multímeros basados en unidades de trímeros (Documentos no de Patente 2 y 3) .

Se ha informado sobre la relación entre las estructuras de la adiponectina y el efecto fisiológico, la actividad, etc. Tsao et al. han informado de que el efecto de la activación de NF-kB se observa solo en multímeros de adiponectina que son mayores que un trímero pero no se observa en un trímero y en un dominio globular que carece del dominio similar al colágeno. Utpal et al. han informado de que sólo la adiponectina de peso molecular alto se reduce significativamente mediante la administración de insulina o glucosa, y que la adiponectina en la que la cisteína en el dominio similar al colágeno es sustituida por serina o la adiponectina que ha experimentado un tratamiento de reducción exhiben un fuerte efecto de reducción del azúcar en sangre, pero no se observa sustancialmente un efecto de reducción del azúcar en sangre en la adiponectina que no ha experimentado tratamiento de reducción y en la adiponectina globular (Documento No de Patente 4) .

Sin embargo, la adiponectina empleada en estos estudios referidos se produce a través de la recombinación de genes mediante el uso de E. coli o similares. Por lo tanto, el comportamiento o la acción de la adiponectina que se produce en un organismo no pueden reflejarse con precisión. Además, se sabe que el nivel sanguíneo de la adiponectina difiere entre los sexos. En comparación con los hombres, se ha informado de que las mujeres tienen un nivel de adiponectina en sangre significativamente alto (Documento No de Patente 5) . Una prueba empleando suero de ratón ha revelado que las hembras tienen un contenido particularmente alto en adiponectina de alto peso molecular (Documento No de Patente 4) .

Como se ha descrito anteriormente, a través de la medición solo de la cantidad total de adiponectina, no puede obtenerse suficiente información sobre la relación entre las estructuras de la adiponectina y los efectos fisiológicos o las enfermedades. Por lo tanto, todavía existe la demanda de un método para analizar selectivamente los multímeros de adiponectina presentes en una muestra biológica.

En un método de la técnica anterior para analizar la adiponectina, una muestra que se vaya a medir se hierve en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS) antes de realizar el inmunoanálisis (Documento de Patente 3) . El tratamiento de ebullición permite la exposición de un sitio de reconocimiento de anticuerpos de la adiponectina que ha estado oculto estereoestructuralmente, con el fin de determinar inmunológicamente la cantidad total de adiponectina. Por lo tanto, este método no está dirigido a analizar selectivamente multímeros de adiponectina.

Se ha descrito un método para analizar la adiponectina contenida en una muestra sin tratamiento desnaturalizante con SDS ni tratamiento de desnaturalización térmica (Documento de Patente 1, se describe en el documento que se midió la adiponectina nativa) . Sin embargo, no se ha hecho referencia al análisis selectivo, y este método no puede ser empleado para el análisis selectivo.

[Documento de Patente 1] Documento WO 03/016906 [Documento de Patente 2] Documento JP-A-2002-363094 [Documento de Patente 3] Documento JP-A-2000-304748 [Documento No de Patente 1] Yamauchi T., et al., Nat. Med.., 7, 941-946, 2001 [Documento No de Patente 2] Nakano Y., et al., J. Biochem., 120, 803-812, 1996 [Documento No de Patente 3] Tsao TS., Et al., J. Biol.. Chem.., 277, 29359-29362, 2002 [Documento No de Patente 4] Pojvani, et al., J. Biol.. Chem.., 278, 9073-9085, 2003 [Documento No de Patente 5] Yamamoto Y., et al., Clin. Ciencia., 103, 137-142, 2002

Descripción de la Invención

Problemas a Resolver por la Invención

La presente invención proporciona un método para analizar selectivamente un multímero de adiponectina diana seleccionado entre adiponectina peso molecular medio (Ad PMM) o adiponectina de peso molecular ultrabajo (Ad PMUB) en una muestra biológica. Se describe un método para evaluar con precisión la relación entre una enfermedad y la adiponectina través del análisis selectivo de los multímeros de adiponectina. El análisis selectivo proporciona una información que no puede obtenerse a través de la medición solo de la cantidad total de adiponectina.

Medios para Resolver el Problema

Con el fin de resolver los problemas, los autores de la presente invención han realizado extensos estudios y han encontrado que la sangre contiene adiponectina que puede ser clasificada en los siguientes tres tipos sobre la base del peso molecular medido mediante cromatografía de filtración en gel; 150 kDa o más y 200 kDa o menos (principalmente cerca de 160 kDa) (denominada en lo sucesivo Ad PMB) , más de 200 kDa y menos de 400 kDa (principalmente cerca de 260 kDa) (denominada en lo sucesivo Ad PMM) , y 400 kDa o más y 800 kDa o menos (principalmente cerca de 450 kDa) (denominada en lo sucesivo Ad PMA) . Los autores de la presente invención han realizado estudios adicionales, y finalmente tuvieron éxito en la obtención de cuatro tipos de productos separados y purificados de multímeros de adiponectina de la sangre humana. Estos cuatro tipos pueden ser separados a través de electroforesis en poliacrilamida (2 a 15%) (en adelante puede ser referida como "PAGE (2 a 15%) ") en condiciones no desnaturalizantes, y se definen como Ad PMUB, Ad PMB, Ad PMM y Ad PMA, de alta movilidad a baja movilidad. De estos cuatro tipos de adiponectina, se encontró que Ad PMB, Ad PMM y Ad PMA corresponden a los tres tipos de adiponectina anteriores contenidos en el suero. Además, los autores de la presente invención han encontrado que Ad PMB es un trímero adiponectina al que está unido la albúmina a través de un enlace disulfuro, y que, mediante el uso combinado de al menos un anticuerpo anti-adiponectina y un anticuerpo anti-albúmina, se puede analizar selectivamente la Ad PMB. Además, los autores de la presente invención han encontrado que, a través del cálculo del peso molecular con electroforesis de SDS-poliacrilamida (2 a 15%) (en adelante se puede denominar "SDS-PAGE") después del entrecruzamiento intramolecular, se determina que la Ad PMUB es un trímero de adiponectina, se deduce que la Ad PMM es un hexámero o nonámero, y se deduce que la Ad PMA es un multímero formado de monómeros cuyo número es el doble o más que de los monómeros que forman la Ad PMM.

Basándose en estos descubrimientos, los autores de la presente invención han encontrado que, a través de reacción de una proteasa adecuada con una muestra que contiene adiponectina, se puede digerir adiponectina distinta de Ad PMA, y que la Ad PMA que permanece después de la digestión con la proteasa se puede... [Seguir leyendo]

1. Un método para someter a inmunoanálisis selectivamente un multímero de adiponectina diana seleccionado entre adiponectina peso molecular medio (Ad PMM) o adiponectina de peso molecular ultra bajo (Ad PMUB) en una muestra biológica, que comprende:

(1) para someter a inmunoanálisis selectivamente adiponectina de peso molecular medio (Ad PMM) :

(a) hacer reaccionar una muestra con una proteasa que digiere específicamente Ad PMUB y LMW Ad;

(b) determinar la cantidad total de la adiponectina Ad PMM y Ad PMA no digerida que queda en la muestra tratada en la etapa (a) ;

(c) determinar la cantidad de Ad PMA en la muestra biológica a través de la reacción de una proteasa con una muestra que contiene adiponectina, mediante la cual se digiere la adiponectina distinta de Ad PMA, y analizar selectivamente la Ad PMA que permanece después de la digestión con la proteasa mediante el uso de un anticuerpo anti-adiponectina, y

(d) restar la cantidad de Ad PMA detectada en (c) de la cantidad total de adiponectina cuantificada en (b) , donde la cantidad de Ad PMM corresponde a la cantidad cuantificada en (b) menos la cantidad de Ad PMA cuantificada en (c) ; o

(e) restar la cantidad total de Ad PMUB y Ad PMB convertidas, que se ha determinado en la etapa (a) de la cantidad total de Ad PMUB, Ad PMB y Ad PMM como la cantidad total de adiponectina convertida mediante el uso de una proteasa para determinar la cantidad de Ad PMA según la etapa (c) ;

(2) para someter a inmunoanálisis selectivamente adiponectina de peso molecular ultra bajo Ad PMUB, la cantidad de Ad PMUB contenida en una muestra se determina

a. tratando la Ad PMUB y la Ad PMB con la proteasa que digiere específicamente Ad PMUB y Ad PMB,

b. calculando la cantidad total de Ad PMA y Ad PMM que queda, y

c. restando de la cantidad total de Ad PMA y Ad PMM y la cantidad de Ad PMB de la cantidad total de adiponectina, que se ha determinado selectivamente, o

d. restando, de la cantidad total de adiponectina, la cantidad total de Ad PMB, Ad PMM y Ad PMA.

2. El método de la reivindicación 1, donde para el inmunoanálisis selectivo de Ad PMM dicha proteasa en la etapa (a) es una proteasa derivada de un microorganismo seleccionado del género Bacillus, Aspergillus, y Staphylococcus.

3. El método de la reivindicación 1, donde la cantidad de Ad PMA en una muestra biológica se cuantifica en la etapa (c) :

(i) haciendo reaccionar la muestra que contiene adiponectina con al menos una proteasa que se puede modificar químicamente para digerir selectivamente adiponectina distinta de Ad PMA en la muestra, donde la al menos una proteasa se selecciona del grupo que consiste en proteinasa K derivada del género Tritirachium y proteasa derivada de un microorganismo perteneciente al género Aspergillus o al género Bacillus, y

(ii) cuantificando inmunológicamente la Ad PMA utilizando un anticuerpo anti-adiponectina.

4. El método de la reivindicación 1, en donde para someter a inmunoanálisis selectivamente la Ad PMM dicha proteasa en la etapa (a) es una proteasa seleccionada del grupo que consiste de proteasa S "Amano", proteasa A "Amano", sumizyme FP, sumizyme LP50D, y proteasa V8 .

5. El método de la reivindicación 1, donde para someter a inmunoanálisis selectivamente la Ad PMB el anticuerpo anti-adiponectina forma un complejo con Ad PMB, y la cantidad del complejo se utiliza para determinar la cantidad de Ad PMB en dicha muestra biológica.

6. El método según la reivindicación 1, donde la muestra biológica se obtiene a partir de un ser humano.