PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DE PROTEÍNA GLICOSILADA.
Un procedimiento para reducir el efecto de un compuesto de fructosil-lisina en el ensayo de fructosil-péptido o fructosil-aminoácido,
caracterizado porque comprende hacer que una fructosil-péptido-oxidasa actúe sobre fructosil-péptido o fructosil-aminoácido a un pH de 4,0 a 7,0 y medir el producto resultante a un pH de 4,0 a 7,0
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2004/017195.
Solicitante: Sekisui Medical Co., Ltd.
Nacionalidad solicitante: Japón.
Dirección: 13-5, NIHONBASHI 3-CHOME CHUO-KU, TOKYO 103-0027 JAPON.
Inventor/es: TANIGUCHI,Yuriko,Diagnostics Research Lab, EBINUMA,Hiroyuki,Diagnostics Research Lab, Saito,Kazunori,Diagnostics Research Lab.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 18 de Noviembre de 2004.
Clasificación Internacional de Patentes:
- G01N33/68A2D
- G01N33/72B6
Clasificación PCT:
- C12Q1/26 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una oxidorreductasa.
- C12Q1/28 C12Q 1/00 […] › una peroxidasa.
- C12Q1/37 C12Q 1/00 […] › peptidasa o proteinasa.
- G01N33/72 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen pigmentos de la sangre, p. ej. la hemoglobina, la bilirrubina.
Clasificación antigua:
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre.
PDF original: ES-2363228_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Campo técnico
La presente invención se refiere a un procedimiento para ensayar proteína glicosilada, péptido glicosilado o aminoácido glicosilado contenido en una muestra.
Técnica anterior
La proteína glicosilada es una proteína no enzimáticamente glicosilada que es un compuesto de Amadori que se forma a partir de la transposición de Amadori tras la formación de una base de Schiff entre el grupo aldehído de un azúcar y el grupo amino de una proteína. Las proteínas glicosiladas están ubicuamente presentes en el cuerpo vivo. El nivel de concentración de proteína glicosilada en sangre está ampliamente influido por la concentración de monosacárido (por ejemplo, glucosa) disuelto en suero. Proteínas glicosiladas a modo de ejemplo incluyen proteínas cuyo grupo α-amino en el extremo amino está glicosilado (por ejemplo, hemoglobina glicosilada) y proteínas cuyos grupos ε-amino contenidos en residuos de lisina internos están glicosilados (por ejemplo, albúmina glicosilada). La concentración de albúmina glicosilada en suero o la relación de hemoglobina glicosilada con respecto a hemoglobina no glicosilada presente en eritrocitos refleja el nivel de azúcar promedio en un cierto periodo y, por tanto, se usa como un índice para el diagnóstico clínico tal como diagnóstico de diabetes, control de la afección patológica o juicio del efecto terapéutico.
Entre los ensayos de proteína glicosilada hay un procedimiento llamado “procedimiento enzimático” que puede realizarse con facilidad y es adaptable a un analizador automático comúnmente usado en laboratorios clínicos (por ejemplo, Documento de patente 1). El procedimiento enzimático consiste en una etapa de pretratamiento necesaria para la reacción de una proteasa con proteína glicosilada contenida en una muestra para así liberar el péptido glicosilado o aminoácido glicosilado, que sirve de sustrato en la siguiente etapa, y una etapa de ensayo necesaria para la reacción del sustrato libre con una enzima específica de péptido glicosilado o una enzima específica de aminoácido glicosilado (por ejemplo, oxidasa) para así producir una sustancia detectable (por ejemplo, peróxido de hidrógeno) y medir la sustancia. Una glucosa-oxidasa puede hacerse reaccionar con un sacárido liberado para producir peróxido de hidrógeno que puede usarse para medir la proteína glicosilada con una alta sensibilidad (Documento de patente 6).
Sin embargo, ha habido un problema con los procedimientos enzimáticos informados hasta la fecha ya que una proteasa empleada en la etapa de pretratamiento y una enzima específica empleada en la etapa de ensayo no tienen suficiente capacidad para reconocer diferencias entre proteína glicosilada, péptido glicosilado y aminoácido glicosilado (en lo sucesivo pueden denominarse colectivamente “proteína glicosilada o similares”) y, por tanto, si la proteína glicosilada diana coexiste con otra proteína glicosilada que no ha sido elegida como diana para el ensayo, ambas proteínas reaccionan con la enzima específica y así se debilita la especificidad de dicho procedimiento.
Ejemplos de enzima específica de péptido glicosilado o enzima específica de aminoácido glicosilado que se usa en la etapa de pretratamiento incluyen una oxidasa que se produce a partir de una bacteria que pertenece al género Corynebacterium (véase, por ejemplo, Documento de patente 2) y una oxidasa que se produce a partir de una bacteria que pertenece al género Aspergillus (véase, por ejemplo, Documento de patente 3). Estas enzimas reaccionan eficazmente con aminoácido glicosilado, pero tienden a quedar sin reaccionar contra el péptido glicosilado. Recientemente se ha informado de una enzima que se obtiene mediante modificación de una fructosilaminoácido-oxidasa (Documento de patente 4) y una fructosil-péptido-oxidasa derivadas de un hongo filamentoso (Documento de patente 5), además de dos fructosil-péptido-oxidasas de hongos (Documento de no patente 8). Se informa que estas oxidasas reaccionan específicamente con un péptido glicosilado, especialmente fructosilvalilhistidina, a pH 8,0. Un ensayo para fructosil-valina a pH ≤6 usando una fructosil-aminoácido-oxidasa se describe en el Documento de patente 7.
En la medición de hemoglobina glicosilada mediante el uso de una fructosil-aminoácido-oxidasa tal, la especificidad de la oxidasa se deriva de la diferencia en la reactividad de la oxidasa con fructosil-valina (la valina en el extremo amino de la subunidad de hemoglobina β está glicosilada) o fructosil-valilhistidina (un residuo de aminoácido se añade adicionalmente a fructosil-valina) y con ε-fructosil-lisina (el (los) residuo(s) de lisina en una proteína está(n) glicosilado(s)). Una molécula de hemoglobina tiene 44 residuos de lisina. Por tanto, incluso cuando la reactividad de una oxidasa con ε-fructosil-lisina sea baja, el efecto total de los residuos de ε-fructosil-lisina no debería ser ignorado. Además, un compuesto que contiene fructosil-lisina y se deriva de hemoglobina u otras proteínas del plasma (por ejemplo, albúmina glicosilada) o se deriva de un alimento o fármaco (en lo sucesivo puede denominarse “compuesto de fructosil-lisina”) tiene que conllevar un riesgo que podría conducir a un error positivo. Un riesgo tal es difícil de evitar mientras se use un procedimiento de ensayo convencional.
[Documento de patente 1] JP-A-1999-127895 [Documento de patente 2] Publicación de patente japonesa (kokoku) nº H5-33997(1993)
[Documento de patente 3] JP-A-1991-155780 [Documento de patente 4] JP-A-2001-95598 [Documento de patente 5] JP-A-2003-235585 [Documento de patente 6] JP-A-2000-333696 [Documento de patente 7] JP-A-2001-204494 [Documento de no patente 8] Hirokawa, K., Gomi, K. y Kajiyama, N. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 311, 104-111
Divulgación de la invención
Problema(s) que va(n) a resolverse por la invención
Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento eficiente conveniente para ensayar proteína glicosilada, fructosil-péptido o fructosil-aminoácido, que puede aplicarse a una variedad de analizadores automáticos a la vez que se reduce efecto de compuestos de fructosil-lisina, y un reactivo empleado en el procedimiento.
Medios para resolver el problema
En vista de lo anterior, los presentes inventores han realizado amplios estudios y han encontrado que, en el ensayo de proteína glicosilada, fructosil-péptido o fructosil-aminoácido, el efecto de los compuestos de fructosil-lisina presentes en el sistema de reacción puede reducirse haciendo que una enzima para ensayar fructosil-péptido o fructosil-aminoácido (en lo sucesivo puede denominarse “enzima de ensayo”) actúe sobre fructosil-péptido o fructosil-aminoácido a un pH de 4,0 a 7,0. La presente invención se ha realizado basándose en este hallazgo.
La presente invención proporciona un procedimiento para reducir el efecto de un compuesto de fructosil-lisina en el ensayo de fructosil-péptido o fructosil-aminoácido, caracterizado porque comprende hacer que una fructosil-péptidooxidasa actúe sobre fructosil-péptido o fructosil-aminoácido a un pH de 4,0 a 7,0 y medir el producto resultante a un pH de 4,0 a 7,0.
La presente invención también proporciona un procedimiento para reducir el efecto de un compuesto de fructosillisina en el ensayo de proteína glicosilada de una muestra, caracterizado porque comprende tratar la muestra que contiene la proteína glicosilada con una proteasa para así liberar fructosil-péptido o fructosil-aminoácido libre, hacer que una fructosil-péptido-oxidasa actúe sobre la liberación de fructosil-péptido o fructosil-aminoácido a un pH de 4,0 a 7,0 y medir el producto resultante a un pH de 4,0 a 7,0.
También se describe un reactivo para ensayar proteína glicosilada con efecto reducido de un compuesto de fructosillisina que contiene al menos (A) una proteasa, (B) una fructosil-péptido-oxidasa que actúa sobre fructosil-péptido o fructosil-aminoácido a un pH de 4,0 a 7,0 para así producir peróxido de hidrógeno, y (C) un reactivo para medir peróxido de hidrógeno.
La presente invención también proporciona un procedimiento para reducir el efecto de un compuesto de fructosillisina en el ensayo de fructosil-péptido o fructosil-aminoácido, caracterizado porque comprende hacer que actúen al menos los (A) a (C) siguientes sobre fructosil-péptido o fructosil-aminoácido a un pH de 4,0 a 7,0: (A) una fructosilpéptido-oxidasa, (B) un reactivo para medir peróxido de... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para reducir el efecto de un compuesto de fructosil-lisina en el ensayo de fructosil-péptido o fructosil-aminoácido, caracterizado porque comprende hacer que una fructosil-péptido-oxidasa actúe sobre fructosil-péptido o fructosil-aminoácido a un pH de 4,0 a 7,0 y medir el producto resultante a un pH de 4,0 a 7,0.
2. Un procedimiento para reducir el efecto de un compuesto de fructosil-lisina en el ensayo de una proteína glicosilada contenida en una muestra que contiene la proteína glicosilada, caracterizado porque comprende tratar la muestra con una proteasa para así liberar fructosil-péptido o fructosil-aminoácido libre, hacer que una fructosilpéptido-oxidasa actúe sobre la liberación de fructosil-péptido o fructosil-aminoácido a un pH de 4,0 a 7,0 y medir el producto resultante a un pH de 4,0 a 7,0.
3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que la proteína glicosilada es hemoglobina glicosilada.
4. El procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, en el que la proteasa se deriva de un microorganismo que pertenece al género Bacillus, Aspergillus o Streptomyces o se obtiene de un gen del microorganismo mediante una tecnología de recombinación de genes.
5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fructosil-péptido es fructosilvalilhistidina.
6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fructosil-aminoácido es fructosilvalina.
7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el producto es peróxido de hidrógeno.
8. Un procedimiento para reducir el efecto de un compuesto de fructosil-lisina en el ensayo de fructosil-péptido o fructosil-aminoácido, caracterizado porque comprende hacer que actúen al menos los (A) a (C) siguientes sobre fructosil-péptido o fructosil-aminoácido a un pH de 4,0 a 7,0
(A) una fructosil-péptido-oxidasa,
(B) un reactivo para medir peróxido de hidrógeno, y
(C) una enzima oxidante y de descomposición de glucosona.
9. Un procedimiento para reducir el efecto de un compuesto de fructosil-lisina en el ensayo de proteína glicosilada contenida en una muestra, caracterizado porque comprende tratar la muestra con una proteasa para así liberar fructosil-péptido o fructosil-aminoácido y hacer que actúen al menos los (A) a (C) siguientes sobre la liberación de fructosil-péptido o fructosil-aminoácido a un pH de 4,0 a 7,0:
(A) una fructosil-péptido-oxidasa,
(B) un reactivo para medir peróxido de hidrógeno, y
(C) una enzima oxidante y de descomposición de glucosona.
10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que la proteína glicosilada es hemoglobina glicosilada.
11. El procedimiento según la reivindicación 9 ó 10, en el que la proteasa se deriva de un microorganismo que pertenece al género Bacillus, Aspergillus o Streptomyces o se obtiene de un gen del microorganismo mediante una tecnología de recombinación de genes.
12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el fructosil-péptido es fructosilvalilhistidina.
13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el fructosil-aminoácido es fructosil-valina.
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