Método para determinar la causa de la prolongación del tiempo de coagulación sanguínea.

Un método de determinación de una causa de la prolongación del tiempo de coagulación sanguínea en plasma de ensayo,

comprendiendo el método:

(1) medir los tiempos de coagulación sanguínea de muestras que incluyen (a) solo plasma del ensayo, (b) solo plasma normal, y (c) el plasma de ensayo y el plasma normal mezclados al menos a una proporción de mezcla; (2) dibujar un gráfico de línea poligonal representando gráficamente los resultados de medición de las muestras (a), (b) y (c), representando un eje vertical el tiempo de coagulación sanguínea o una proporción de prolongación del tiempo de coagulación sanguínea y representando el eje horizontal la relación de mezcla o la proporción de mezcla del plasma de ensayo o del plasma normal, y por lo tanto determinando un área A bajo la línea poligonal y un área B bajo el segmento de la línea que conecta los resultados de medición representados gráficamente de las muestras (a) y (b);

(3) calcular una proporción del área (A-B) obtenida restando el área B del área A, con respecto al área B, ((A15 B)/(B)): proporción de área X);

(4) realizar las etapas de (1) y (2) para un plasma positivo a un inhibidor de factores de coagulación y de este modo determinando de antemano la proporción de área patrón Y; y

(5) comparar la proporción de área X y la proporción de área patrón Y, y determinar el plasma de ensayo como un tipo de inhibidor de factor de coagulación en el caso en el que Y ≤ X, o un tipo deficiente en factor de coagulación en el caso en el que Y >X.

Método para determinar la causa de la prolongación del tiempo de coagulación sanguínea

Campo técnico La presente invención se refiere a un método para determinar una causa de la prolongación del tiempo de coagulación sanguínea en una muestra de sangre.

Antecedentes de la técnica Un ensayo de coagulación sanguínea se realiza para explorar la presencia o ausencia de cualquier anomalía en el sistema de reacción de coagulación sanguínea, o para medir la actividad de factores individuales, midiendo el inicio del período de tiempo desde el momento en el que se añade un activador y/o Ca2+ y similar en un espécimen o en una mezcla de especímenes, hasta el momento en el que se formen coágulos de fibrina detectables (tiempo de coagulación sanguínea; en lo sucesivo en el presente documento, ocasionalmente también denominado simplemente como tiempo de coagulación) . Los ejemplos típicos del tiempo de coagulación sanguínea incluyen el tiempo de protrombina (TP) , el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) y tiempo de trombina.

El TP es el tiempo que transcurre desde la adición de un líquido mixto de tromboplastina tisular y Ca2+ a un plasma de ensayo hasta la coagulación del plasma sanguíneo, y el objeto del TP es realizar un examen exhaustivo de las actividades de coagulación del factor VII, factor X, factor V, protrombina, fibrinógeno y similares, que están relacionadas con la ruta de coagulación extrínseca. El TTPA es el tiempo que transcurre desde la adición de una cantidad suficiente de fosfolípidos y un agente activador (caolín, anhídrido silícico, ácido elágico o similar) y una cantidad apropiada de Ca2+ a un plasma de ensayo hasta la coagulación del plasma sanguíneo, y el objeto del TTPA es realizar un examen exhaustivo de las actividades de coagulación de factor XII, factor XI, precalicreína, quininógeno de alto peso molecular, factor IX, factor VIII, factor X, factor V, protrombina, fibrinógeno y similar, que están relacionados con la ruta de coagulación intrínseca. En general, lo que se conoce como anomalías en estos ensayos de coagulación sanguínea es la prolongación del tiempo de coagulación. Las anomalías en los sistemas de reacción de coagulación sanguínea reflejan los síntomas de la tendencia a hemorragia o de la tendencia a trombosis (tendencia a la coagulación sanguínea) en el organismo.

Las causas de estas anomalías que pueden considerarse incluyen: 1) un déficit o una disminución en los factores de coagulación sanguínea, 2) la presencia de un anticuerpo contra un componente sanguíneo que constituye el sistema de coagulación sanguínea, 3) la presencia de un anticuerpo contra un componente en el reactivo para medir el tiempo de coagulación sanguínea, 4) la presencia de un anticuerpo contra un compuesto entre un componente sanguíneo que constituye el sistema de coagulación sanguínea y un componente en el reactivo para medir el tiempo de coagulación sanguínea y 5) la administración de un fármaco que inhibe la reacción de la coagulación sanguínea.

Sin embargo, realizando simplemente la medición del tiempo de coagulación sanguínea no permite diferenciar si la causa es una disminución en la actividad debido a un simple déficit de factores de coagulación, o una disminución en la actividad debido a la inhibición de la reacción de coagulación por un anticuerpo (inhibidor) contra un componente o similar en un componente que constituye el sistema de coagulación sanguínea o un componente en el reactivo para medir el tiempo de coagulación sanguínea. Adicionalmente, dado que la actuación terapéutica varía 45 con la diferencia en las causas, la diferenciación de las causas es importante. Por tanto, se ha realizado un ensayo de corrección de coagulación sanguínea (ensayo mixto) en el que a un plasma de ensayo se le añade plasma normal, y se representa el grado del tiempo de coagulación sanguínea del plasma de ensayo que se está corrigiendo (normalizado) para determinar la causa (Documento no Patente 1) .

El ensayo mixto se ha realizado tradicionalmente, por ejemplo, de la manera descrita a continuación.

Se prepara una muestra añadiendo plasma normal a plasma de ensayo y se mezclan de tal manera que la proporción del plasma normal sea de 0, 20, 50, 80 o 100 %, y se mide el TTPA. Los resultados se representan en un gráfico (eje horizontal: proporción del plasma normal mezclado o la proporción del plasma de ensayo (%) , eje 55 vertical: tiempo de coagulación (segundos) ) , y la causa se determina visualmente a partir de la forma del gráfico. Por ejemplo, en el caso de un déficit de un factor de coagulación, la adición de una pequeña cantidad de plasma normal (20 % en la FIG. 1 (A) ) disminuye significativamente el tiempo de coagulación aproximando de esta manera el tiempo de coagulación al valor que puede obtenerse en el caso de plasma normal. Por lo tanto, el gráfico muestra una curva convexa por debajo de una línea recta (línea de puntos) que conecta los puntos correspondientes al plasma de ensayo y al plasma normal (FIG. 1 (A) ) .

Cuando está presente un inhibidor de un factor de coagulación, el inhibidor inactiva el factor de coagulación en el plasma normal, incluso aunque se aumente la proporción del plasma normal añadido. Por lo tanto, el grado de una mejora en el tiempo de coagulación debido a la adición de plasma normal es bajo, y se muestra una curva convexa 65 por debajo de la línea recta (FIG. 1 (B) ) .

Sin embargo, dependiendo del espécimen, puede obtenerse un gráfico con una forma similar a la línea de puntos (FIG. 1 (C) ) y en ese caso, existe un problema de que es muy difícil realizar una determinación.

Adicionalmente, dado que el ensayo mixto implica realizar una determinación por inspección visual, no hay ningún método unificado para cuantificar el grado de corrección, y la determinación final se encomienda al evaluador. Por lo tanto, existe otro problema de que es posible que el resultado de la determinación haya cambiado dependiendo del grado de destreza del evaluador.

Además, también existe la posibilidad de que el resultado de la determinación pueda variar dependiendo de la diferencia en la sensibilidad del reactivo para medir el inhibidor del factor de coagulación. Particularmente, el anticoagulante lúpico (en lo sucesivo en el presente documento AL) se conoce como un inhibidor de factores de coagulación que depende de la sensibilidad del reactivo. El AL no es un inhibidor contra factores de coagulación individuales, sino una inmunoglobulina que inhibe la reacción de coagulación dependiente de fosfolípidos. Dado que la presencia de fosfolípidos es esencial para la reacción de coagulación, normalmente, muchos de los reactivos para medir la coagulación sanguínea son ricos en fosfolípidos. El AL reacciona con los fosfolípidos en el reactivo, consumiendo de esta manera estos fosfolípidos, y consecuentemente inhibe la reacción de coagulación. Por lo tanto, ensayos de coagulación, tales como el TP y el TTPA a menudo se encuentra que son anómalos. Sin embargo, dado que el AL produce intensidades de reacción que varían con el tipo de fosfolípidos (origen, composición del fosfolípido y similar) , se sabe que se obtienen diferentes resultados de determinación en base al reactivo usado.

También hay métodos conocidos, como los que se indican más adelante, para la determinación, que no dependen del grado de destreza del evaluador y que facilitan la determinación (Documento 2 no Patente) . Cuando el tiempo de coagulación para un plasma de ensayo se denomina a, el tiempo de coagulación para una mezcla de un plasma de ensayo y un plasma normal a una proporción de mezcla de 5:5 se denomina b, y el tiempo de coagulación para un plasma normal se denomina c,

1) (a+c) / 2 ≤ b, 2) (b-c) / a≥x, 3) b-c≥ x, 4) b/c ≥x

El método de determinación (1) expresa simplemente en valores numéricos si el gráfico es convexo por encima de la línea recta, o si el gráfico es convexo por debajo de la línea recta y por tanto la determinación por inspección visual y el resultado no cambian. El método de determinación (2) también se conoce como Ã?ndice de Rosner, y se considera como un método de determinación útil para determinar el AL en particular. En este método, se considera que un valor de 0, 15 es apropiado para x, pero este valor es un valor establecido para el tiempo de coagulación con caolín (TCC) . Realmente, cada reactivo usado en diversos centros requiere un ajuste apropiado para x, pero los métodos para dicho ajuste no se conocen claramente (Documento no Patente 3) . Los métodos de determinación (3) y (4) también requieren ajustar x para diversos centros, pero los métodos de dichos ajustes no... [Seguir leyendo]

1. Un método de determinación de una causa de la prolongación del tiempo de coagulación sanguínea en plasma de ensayo, comprendiendo el método: 5

(1) medir los tiempos de coagulación sanguínea de muestras que incluyen (a) solo plasma del ensayo, (b) solo plasma normal, y (c) el plasma de ensayo y el plasma normal mezclados al menos a una proporción de mezcla;

(2) dibujar un gráfico de línea poligonal representando gráficamente los resultados de medición de las muestras (a) , (b) y (c) , representando un eje vertical el tiempo de coagulación sanguínea o una proporción de prolongación

del tiempo de coagulación sanguínea y representando el eje horizontal la relación de mezcla o la proporción de mezcla del plasma de ensayo o del plasma normal, y por lo tanto determinando un área A bajo la línea poligonal y un área B bajo el segmento de la línea que conecta los resultados de medición representados gráficamente de las muestras (a) y (b) ;

(3) calcular una proporción del área (A-B) obtenida restando el área B del área A, con respecto al área B, ( (A15 B) / (B) ) : proporción de área X) ;

(4) realizar las etapas de (1) y (2) para un plasma positivo a un inhibidor de factores de coagulación y de este modo determinando de antemano la proporción de área patrón Y; y

(5) comparar la proporción de área X y la proporción de área patrón Y, y determinar el plasma de ensayo como

un tipo de inhibidor de factor de coagulación en el caso en el que Y ≤ X, o un tipo deficiente en factor de 20 coagulación en el caso en el que Y > X.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la proporción de área patrón Y para el plasma positivo a un inhibidor de factores de coagulación es un valor determinado con respecto a un plasma positivo al inhibidor de factores de coagulación que presenta un tiempo de coagulación sanguínea que es mayor que el límite superior de un intervalo patrón que se ha obtenido procesando estadísticamente el tiempo de coagulación sanguínea de una pluralidad de plasmas de personas sanas, y no es mayor que un valor de límite superior +50 %.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el intervalo patrón para el tiempo de coagulación sanguínea de plasmas de personas sanas se obtiene procesando estadísticamente el tiempo de coagulación sanguínea de una 30 pluralidad de plasmas de personas sanas.

4. El método de la reivindicación 1, en el que cuando el eje vertical X se usa para representar el tiempo de coagulación sanguínea en (2) de la reivindicación 1, los valores obtenidos restando un número constante del mismo se usan para el área A y para el área B.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el número constante se obtiene dibujando una línea auxiliar paralela al eje horizontal y a través del punto del tiempo de coagulación sanguínea representado gráficamente del plasma normal dibujado en el gráfico de línea poligonal, y calculando el área bajo la línea auxiliar.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el tiempo de coagulación sanguínea es al menos uno seleccionado de TP (tiempo de protrombina) , TTPA (tiempo de tromboplastina parcial activada) , TPd (TP diluida) , TTPAd (TTPA diluida) , TCC (tiempo de coagulación con caolín) , y TVVRd (tiempo del veneno de la víbora de Russell diluido) .

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el inhibidor de factores de coagulación es al menos uno seleccionado de anticoagulante lúpico (AL) , un inhibidor del factor VIII, un inhibidor del factor IX, y un inhibidor del factor V.