Anticuerpo anti-Dectin-1 humano, hibridoma productor de dicho anticuerpo y sus aplicaciones.

La presente invención consiste en el hibridoma MGD3 y el anticuerpo monocional producido por él (denominado también MGD3), que reconoce de forma especifica al receptor de membrana Decti-1 humano. El anticuerpo MGD3 es capaz de inhibir la unión de Dectin-1 a su ligando natural, los ·-glucanos que son componentes de la pared de los hongos. Además, bloquea específicamente la unión a Candida albicans así como la secreción de citoquinas inducidas por la misma. El anticuerpo MGD3 obtenido permite la detección in vitro, ex vivo e in vivo de la proteína humana Dectin-1. Del mismo modo, puede emplearse para detectar el nivel de expresión del receptor en leucocitos humanos y para definir el papel de este receptor en la patogenia de enfermedades autoinmunes y de condiciones caracterizadas por inflamación crónica así como para conocer el efecto terapéutico de distintos agentes anti-inflamatorios e inmunosupresores. Además, el anticuerpo MGD3 podría tener potencial terapéutico en enfermedades inflamatorias crónicas

Anticuerpo anti-Dectin-1 humano, hibridoma productor de dicho anticuerpo y sus aplicaciones.

Estado de la técnica

La respuesta inmune innata es la encargada del reconocimiento y contención inmediatos de la invasión microbiana y dirige la respuesta adaptativa contra los patógenos a través del control del crecimiento de los mismos, de la expresión de moléculas co-estimuladoras en los fagocitos, de la presentación antigénica y de la producción de citoquinas y quimioquinas. Estos factores regulan el tráfico de los leucocitos iniciando la respuesta inflamatoria, activan las capacidades microbicidas de los fagocitos y dirigen la polarización de las células T cooperadoras. La respuesta inflamatoria sirve para limitar la infección, pero la inflamación tiene que resolverse para evitar procesos patológicos. En este sentido, se ha propuesto que la producción de citoquinas inhibitorias como la interleuquina (IL)-10 por los neutrófilos, macrófagos, células dendríticas (DCs) y células T reguladoras, tiene un papel importante en las fases tardías de la infección para prevenir una activación excesiva de la respuesta innata y el establecimiento del comensalismo y quizá de la latencia y persistencia del patógeno (Romani 2004).

En la respuesta inmune innata, el reconocimiento de los patógenos se lleva a cabo por las células fagocíticas a través de los receptores de patrones de reconocimiento (PRR, Pattern Recognition Receptor) que detectan estructuras microbianas altamente conservadas. El prototipo de PRR son los TLR (Toll-like receptors), pero recientemente se ha demostrado que también receptores de la familia de las lectinas como Dectin-1 pueden funcionar como PRRs (Akira y Takeda 2004; Gordon 2002; Brown 2005). El receptor de membrana Dectin-1 humano reconoce polisacáridos con enlaces β(1rightarrow3) y/o β(1rightarrow6), los llamados β-glucanos, presentes en la pared de los hongos (Brown y Gordon 2001; Brown et al. 2003). Como consecuencia, Dectin-1 está implicado en la respuesta inmune innata frente a patógenos fúngicos (Brown y Gordon 2003) tanto en humanos como en ratón.

La estructura de este receptor contiene una región extracelular con un único dominio de unión a carbohidratos de tipo CTLD (C-type lectin-like domain) (Weis et al. 1998) conectado al dominio intracelular a través de un cuello y una región transmembrana. Dectin-1 sufre un proceso de procesamiento alternativo que da lugar a varias isoformas, sólo dos de ellas funcionales: Dectin-1a (completa) y Dectin-1b (predominante, carente del cuello). Aunque parecen funcionar de manera similar in vitro, se expresan de forma diferencial según el tipo celular (Willment et al. 2001, Heinsbroek et al. 2006). En su tallo citoplasmático posee un motivo semi-ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) con dos residuos de tirosina potencialmente fosforilables, implicado en activación celular (Gantner et al. 2003; Brown et al. 2003; Gordon 2002).

Identificado inicialmente en macrófagos de ratón como el receptor principal de β-glucanos (Brown y Gordon 2001; Willment et al. 2005), Dectin-1 media la unión, captación y eliminación de patógenos, dispara la respuesta oxidativa generando especies reactivas de oxígeno (ROS) y produce citoquinas pro-inflamatorias y quimioquinas. Además, Dectin-1 está implicado en fenómenos de tolerancia y control de la respuesta inmune puesto que puede inducir la generación de citoquinas inhibitorias (Interleuquina (IL)-10, IL-2). Estas funciones pueden influenciar la respuesta inmune resultante y, en ciertas circunstancias, llevar a procesos patológicos y de autoinmunidad (Haskard y Landi 2002). Aunque se consideraba que Dectin-1 se expresaba de forma mayoritaria en células dendríticas (DCs) inmaduras y en células de Langerhans y que los estímulos de maduración disminuían su expresión (Ariizumi et al. 2000; Hermanz-Falcon et al. 2001; Sobanov et al. 2001; Yokota et al. 2001), posteriormente se comprobó que Dectin-1 no está restringido al linaje mieloide, sino que también se expresa en neutrófilos, eosinófilos, células B y una sub-población de célu- las T (Brown et al. 2002; Taylor et al. 2002; Willment et al. 2005) aunque no en todos los tejidos (Reíd. et al. 2004).

Dectin-1 es crucial en la respuesta inmune frente a patógenos fúngicos vivos como Candida albicans (Gantner et al. 2005; Taylor et al. 2007), Coccidiodes posadasii (Viriyakosol et al. 2005), Pneumocystis carinii (Steele et al. 2003 y 2005) y Aspergillus fumigatus (Hohl et al. 2005; Steele et al. 2005; Gersuk et al. 2006). La relevancia de este receptor se ha establecido gracias a la generación de ratones deficientes en el gen que codifica para Dectin-1, en los cuales se ha visto que aumenta la susceptibilidad a C. albicans (Taylor et al. 2007) y a P. carinii (Saijo et al. 2007). No obstante, el papel que desempeña Dectin-1 en el control de la infección es aún controvertido. En cualquier caso, se ha demostrado que Dectin-1 puede desencadenar respuestas específicas contra patógenos en colaboración con los TLRs o de forma independiente de ellos. En la vía independiente de TLRs la unión del ligando provoca una cascada de señalización intracelular: la fosforilación de la tirosina proximal del motivo de activación ITAM por la tirosina quinasa Src, permite reclutar la tirosina quinasa de bazo (Syk, Spleen Tyrosine Kinase). Syk es necesaria para la señalización a través del receptor específico de antígeno de células T y B, y en células mieloides se ha descrito como crucial para estimular la producción de especies de oxígeno reactivas a través de Dectin-1 (Underhill et al. 2005; Rogers et al. 2005). Tras la activación de Syk, se produce una cascada de fosforilación que implica entre otros, al factor de transcripción NF-κB (Dennehy. y Gordon 2007; Dennehy et al. 2008). Recientemente, se ha demostrado que la señalización vía Dectin-1 (inducida por β-glucano particulado (zymosan) o con esporas de C. albicans) puede modular directamente la expresión génica a través de la activación del factor de transcripción NFAT, tanto en macrófagos como en DCs, induciendo a su vez los factores de transcripción Egr2, Egr3 y COX-2 (Goodridge. et al. 2007). Además, Dectin-1 participa en una nueva ruta de señalización independiente de TLRs en DCs, mediando directamente la activación de NF-κB vía la molécula adaptadora de señalización CARD9 (Gross et al. 2006). La ruta Dectin-1-Syk-CARD9 acopla la respuesta inmune y la adaptativa, siendo CARD9 necesaria para el desarrollo de una respuesta de tipo linfocito T cooperador (T_H-17) frente a patógenos como C. albicans (LeibundGut-Landmann et al. 2007).

Bibliografía

1. Akira S. & Takeda K. Toll-like receptor signalling. Nat. Rev. Immunol. 4: 499-511 (2004).

2. Ariizumi K. et al. Identification of a novel, dendritic cell-associated molecule, Dectin-1, by substractive cDNA cloning. J. Biol. Chem. 275: 20157-67 (2000).

3. Brown G.D. & Gordon S. Immune recognition. A new receptor for beta-glucans. Nature 413: 36-7 (2001).

4. Brown GD. et al. Dectin-1 is a major beta-glucan receptor on macrophages. J Exp Med 196: 407-12 (2002).

5. Brown GD. et al. Dectin-1 mediates the biological effects of beta-glucans. J. Exp. Med. 197: 1119-24 (2003).

6. Brown GD & Gordon S. Fungal β-Glucans and Mammalian Immunity. Immunity, 19: 311-315, (2003).

7. Brown G.D. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nature Rev. Immunol. 6: 33-43 (2005).

8. Dennehy K.M. & Gordon D.B. The role of the β-glucan receptor Dectin-1 in control of fungal infection. J. Leuk. Biol. 82(2): 253-8. Epub 2007 May 2. Review. (2007).

9. Dennehy K.M et al. Syk kinase is required for collaborative cytokine production induced through Dectin-1 and Toll-like receptors. Eur. J. Immunol. (2008).

10. Gantner B.N. et al, Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197: 1107-17...

1. Anticuerpo anti-Dectin-1 humano caracterizado porque se une y reconoce específicamente el dominio 71-247 de la proteína humana Dectin-1 (SEQ ID NO2) ya sea un anticuerpo monoclonal o policlonal.

2. Anticuerpo según las reivindicación 1 caracterizado porque es monoclonal y es producido por el hibridoma MGD3 (depositado en la colección de cultivos ECACC -European Collection of Animal Cell Culture- el 6 de Febrero de 2008 con la referencia 08020601).

3. Secuencia de nucleótidos caracterizada por ser codificante del dominio 71-247 de la proteína humana Dectin-1 (SEQ ID NO1) y por ser seleccionada del siguiente grupo: