ALFA-N-METILACIÓN DE AMINOÁCIDOS.

Un método para la α N-metilación de un aminoácido o un péptido en una resina en fase sólida que comprende los pasos de:

a) poner en contacto el aminoácido o péptido con 5-clorodibenzosuberano (Dbs-Cl), b) poner en contacto el producto del paso a) con formaldehído o un equivalente de formaldehído protegido, c) poner en contacto el producto del paso b) con un agente reductor; y d) poner en contacto el producto del paso c) con TFA al 5%

La presente invención está relacionada con la síntesis de aminoácidos αN-metilados. En la síntesis de péptidos, la αN-metilación del enlace amida a menudo sirve para evitar la susceptibilidad proteolítica, potenciando la estabilidad del péptido con una perturbación estructural mínima. La metilación de 5 aminoácidos se remonta al trabajo de Emil Fischer, que fue el primero en conseguir la monometilación de α-aminoácidos (Fischer, E.; Lipschitz, W. Chem. Ber. 1915,48, 360.). La ruta sintética en tres fases de Fischer comprende los tres pasos clave siguientes: protección transitoria del grupo α-amino primario para dejar un solo grupo N-H, αN-metilación para reemplazar el N-H por un grupo N-CH3, y desprotección del grupo protector transitorio para liberar el, ahora secundario, αN-metilaminoácido. A pesar de las diferencias en pequeños detalles químicos, 10 aún se utilizan los mismos tres pasos clave en muchas de las reacciones químicas de αN-metilación empleadas hoy en día, varios cientos de años después del trabajo seminal de Fischer. Analizada en detalle, la reacción química original de Fischer fue problemática por dos razones. Primero, su utilización de un grupo protector de toluensulfamida (tosilamida) en el primer paso como protección transitoria conlleva un reacción química de desprotección sumamente agresiva en el tercer paso – HCl conc. a reflujo - 15 incompatible con los enlaces amida y, de hecho, con muchas cadenas laterales proteinogénicas. Segundo, la reacción química de metilación en el segundo paso ocurre bajo unas condiciones fuertemente alquilantes y promotoras de racemización. Por estas razones, desde entonces la mayoría de los esfuerzos en la síntesis se han concentrado en el desarrollo de metodologías menos agresivas para esta secuencia de reacción en tres pasos.

La primera mejora en la reacción química de αN-metilación fue descrita por Quitt et al., en la que la 20 reacción de Leukart fue utilizada para la metilación de αN-bencilaminoácidos (Quitt, P. en Proceedings of the 5th European Peptide Symposium Oxford, UK, 1963, págs. 165-169). La quimioselectividad y baja agresividad de esta reacción – ambas críticas para la tolerancia de grupos funcionales y, por consiguiente, para su aplicabilidad general – permitieron la generación de αN-metilaminoácidos estereoquímicamente puros con una serie de grupos funcionales proteinogénicos (aunque no todos), como fue 25 descrito más tarde por Ebata et al. (Ebata, M.; Takahashi, Y.; Otsuka, H. Bull. Chem.Soc. Jpn. 1966, 39, 2535). Como estas reacciones alcanzan el tercer paso – la N-desprotección – mediante hidrogenación catalítica, aparecen el envenenamiento catalítico por los aminoácidos sulfurosos, reducción de los indoles del Trp e insolubilidad de los aminoácidos en las reacciones de hidrogenación, y todos estos problemas, en general, acaban dando lugar a bajos rendimientos. No obstante, esta reacción química estableció un punto de referencia para subsiguientes síntesis de 30 αN-metilaminoácidos estereoquímicamente puros.

Desde que se demostró la eficacia de la reacción de Leukart para la αN-metilación, se han descrito, a lo largo de los años subsiguientes, otros muchos métodos para esta transformación, con grados variables de complejidad. Estos se han revisado en detalle en otras publicaciones, pero mayormente fueron innovaciones que permitieron el acceso a estructuras específicas, tales como sintones producidos naturalmente, y que no fueron 35 diseñadas como metodologías de aplicación general para la αN-metilación (Aurelio, L.; Brownlee, R. T. C.; Hughes, A. B. Chem. Rev. 2004, 104, 5823-5846; Sagan, S.; Karoyan, P.; Lequin, O.; Chassaing, G.;Lavielle, S. Curr. Med. Chem. 2004, 11, 2799-2822). Una clase notable de reacciones químicas se centraron en las 5-oxazolidinonas de los αN-carbamoil o acil-aminoácidos, que en general se preparaban mediante ciclodeshidratación desde una fuente de formaldehído y luego reducción para producir los αN-metilaminoácidos αN-protegidos (Reddy, G. V.; Rao, G. V.; 40 Iyengar, D. S. TetrahedronLett. 1998, 39, 1985-1986; Freidinger, R. M.; Hinkle, J. S.; Perlow, D. S.; Arison, B. H. J. Org. Chem. 1983, 48, 77). Otra notable (y elegante) reacción química incluye la reacción Aza-Diels Alder, en la que un intermediario metiliminio es capturado mediante cicloadición con ciclopentadieno, seguido de una cicloreversión catalizada por ácido y una reducción de silano para producir el αN-metilaminoácido (Grieco, P. A.; Bahsas, A. J. Org. Chem. 1987, 52, 5746-5749). 45 Todas las reacciones químicas mencionadas anteriormente son esencialmente no aplicables a la metilación en fase sólida por dos razones principales. En primer lugar, la mayoría emplea la hidrogenación catalítica, la cual se conoce que es incompatible con la síntesis en fase sólida, dada la virtual impenetrabilidad del soporte sólido a las partículas catalizadoras empleadas en estas reacciones. Segundo, en las reacciones químicas que emplean grupos αN-protectores transitorios que no se pueden eliminar mediante hidrogenación catalítica, la fase final de 50 desprotección se completa con ácidos fuertes, que son incompatibles con muchos grupos protectores y con las uniones entre el péptido y la resina utilizados en la SPPS (síntesis de péptidos en fase sólida) actual. No fue hasta la innovación de Kaljuste y Undén de una nueva reacción química en tres pasos, que pudo emplearse la metilación reductiva en la síntesis de péptidos en fase sólida de acuerdo con la estrategia de Boc/Bzl (Kaljuste, K.; Undén, A. Int. J.Pept. Prot. Res. 1993, 42, 118-124). 55

En esta reacción química, se usa el cloruro de 4,4'- dimetoxidifenilmetilo (Dod-Cl) como agente alquilante para la resina peptídica αN-desprotegida. En el segundo paso, el extremo αN-terminal, ahora secundario, se metila reductivamente usando formaldehído y NaCNBH3 como agente reductor. El paso final de desprotección se lleva a

cabo con TFA:CH2Cl2 1:1 en la fase sólida, liberando el catión Dod y el nuevo residuo αN-metilaminoácido terminal. Las ventajas de esta reacción química se originan en su baja agresividad – la ausencia de base fuerte, alquilación SN2, catálisis heterogénea y calor- y todo ello la hace completamente apropiada para la αN-metilación sobre resina en el contexto de la SPPS con Boc/Bzl. No obstante, esta reacción química requiere la utilización de un ácido fuerte para el paso de desprotección final; la desprotección del αN-Dod terminal conlleva una exposición prolongada (1 5 hora) a altas concentraciones de TFA (50% v/v en CH2Cl2). Por ello, esta reacción química es fundamentalmente incompatible con la actual SPPS con Fmoc/tBu, en la que esas elevadas concentraciones de ácido eliminarían de forma efectiva los grupos protectores de las cadenas laterales y/o escindirían la unión péptido-resina. La primera reacción química de metilación compatible con la metilación sobre resina junto con la SPPS con Fmoc/tBu fue la reacción química de Fukuyama basada en nitrobencenosulfonamida (Fukuyama, T.; Jow, C. K.; 10 Cheung, M. Tetrahedron Lett. 1995, 36,6373-6374, Miller, S. C.; Scanlan, T. S. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 2301-2302, Yang, L. H.; Chiu, K. L. TetrahedronLett. 1997, 38, 7307-7310). En esta reacción química, el extremo αN-terminal es sulfonilado con cloruro de 2- o 2,4-dinitrobencenosulfo-nilo. En el siguiente paso, el nitrógeno de la sulfonilamida se alquila – bajo condiciones SN2 o Mitsunobu – para dar lugar a la N-metilsulfonamida. Esta sulfonamida se desprotege entonces en fase sólida mediante el uso de un tiol 15 nucleófilo, como el tiofenol, dejando el extremo αN-metilo terminal, ahora secundario. Esta reacción química tiene la ventaja de ser completamente ortogonal, en teoría, a los grupos protectores de las cadenas laterales y a los anclajes péptido-resina empleados ordinariamente en la SPPS con Fmoc/tBu, y se ha utilizado para la preparación de αN-metilaminoácidos únicos seleccionados en fase sólida, así como de péptidos cortos (Lin, X. D.; Dorr,H.; Nuss, J. M. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 3309-3313, Biron, E.; Chatterjee, J.; Kessler, H. Journal of Peptide Science 2006, 12, 20 213-219, Biron, E.; Kessler, H. J. Org. Chem. 2005, 70, 5183-5189). No obstante, incluso en la primera publicación de esta reacción química, se mostró que ésta era moderadamente o completamente incompatible con aminoácidos portadores de cadenas laterales nucleófilas, especialmente Met y Arg(Pbf). Estos problemas de quimioselectividad se expusieron subsiguientemente en otra publicación por Rivier et...

1. Un método para la αN-metilación de un aminoácido o un péptido en una resina en fase sólida que comprende los pasos de: a) poner en contacto el aminoácido o péptido con 5-clorodibenzosuberano (Dbs-Cl),

b) poner en contacto el producto del paso a) con formaldehído o un equivalente de formaldehído protegido, 5 c) poner en contacto el producto del paso b) con un agente reductor; y d) poner en contacto el producto del paso c) con TFA al 5%.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el aminoácido se selecciona de entre el grupo de la Arg(Pbf) [Pbf = 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonamida], metionina, triptófano y cisteína. 3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el aminoácido contiene un grupo protector de cadena 10 lateral. 4. El método de las reivindicaciones de 1 a 3, en el que el agente reductor es NaCNBH3 o NaBH(OAC)3.