Composición farmacéutica que comprende un preadipocito de cultivo primario,

en la que el preadipocito mantiene de manera estable un gen foráneo que codifica para una proteína que se secreta fuera de la célula y en la que el gen se ha insertado en un vector retroviral y se ha transferido a la célula mediante el vector retroviral, en la que la proteína es insulina o péptido 1 similar al glucagón (GLP-1)

Campo técnico

La presente invención se refiere a adipocitos de cultivo primario para terapia génica, a los que se ha transferido un(os) gen(es) foráneo(s).

Antecedentes de la técnica

Las terapias génicas actuales (Toyooka et al., Folia Pharmacol. Jpn. 116:158-162, 2000) pueden clasificarse en dos grupos: (1) métodos de transferencia de genes terapéuticos en pacientes administrando directamente vectores virales, plásmidos desnudos, o de manera que codifiquen para el gen (in vivo), y (2) métodos de extracción temporal de células de pacientes, transferencia de un gen a estas células y luego devolución de estas células al paciente (ex vivo).

En los métodos in vivo, siguen sin resolverse problemas importantes, tales como la eficacia de la transferencia, la expresión continua y la transferencia génica selectiva a células diana. En cambio, los métodos ex vivo pueden superar potencialmente estos problemas. La mayoría de ejemplos de métodos ex vivo se han realizado usando células del sistema sanguíneo (linfocitos periféricos y células de médula ósea), dado que su recogida y trasplante es relativamente fácil y se reduce la carga para los pacientes (Tani et al., Saishin Igaku, 56:258-267, 2001). Con respecto a células distintas de células del sistema sanguíneo, se han llevado a cabo métodos que transfieren genes a hepatocitos y luego devuelven estas células al paciente (Raper, S.E. et al., Cell Transplant 2(5):381-400, 1993), pero la mayoría de estos métodos se centran en la recuperación, el mantenimiento y la potenciación de la función de las propias células transfectadas.

Descripción de la invención

Mientras buscaban células adecuadas para terapia génica ex vivo, los presentes inventores desarrollaron la idea de usar adipocitos de cultivo primario. El uso de adipocitos tiene las siguientes ventajas:

(1) existen muchos informes de factores humorales secretados de adipocitos, y los adipocitos comprenden las funciones de producción de hormonas y pueden actuar como órganos secretores (Bradley R.D., et al., Recent Prog. Horm. Res., 2001, 56, 329-358);

(2) los adipocitos pueden recogerse fácilmente dado que también existen subcutáneamente, y están desarrollándose técnicas relacionadas con su extirpación en los campos de la cirugía plástica y cosmética; además, incluso cuando se injertan adipocitos en tejido subcutáneo, que permite una fácil implantación, estas células no son heterotrópicas dado que pertenecían originalmente a esta región;

(3) dado que los adipocitos de cultivo primario aislados proliferan activamente, incluso in vitro, son apropiados para procedimientos tales como transferencia génica;

(4) dado que los adipocitos es probable que permanezcan en una zona limitada tras su implantación, las células injertadas pueden extirparse tras su implantación si así se desea (específicamente, cuando se quiere eliminar la expresión génica);

(5) dado que los propios adipocitos producen factores angiogénicos (Mick, G.J., et al., Endocrinology 2002, 143(3): 94853), puede esperarse un alto nivel de aceptación del injerto tras su implantación;

(6) la extirpación o implantación de adipocitos tiene un impacto pequeño en el organismo humano porque el peso de este órgano cambia enormemente en los adultos; y

(7) los adipocitos se reconocen ampliamente como superfluos y obstructivos, y puede obtenerse fácilmente el consentimiento para su recogida.

Aunque están en marcha actualmente investigaciones con objetivos similares usando queratinocitos (J. Gene. Med. enero-febrero de 2001, 3 (1):21-31; Histochem. Cell Biol. 2001 Ene, 115(1):73-82), la eliminación de la barrera biológica de la piel en el procedimiento de aislamiento del cultivo primario es problemática considerando el riesgo de infección. Se predice que el dolor del paciente durante la extirpación e implantación es fuerte, y no es fácil volver a extirpar (4, mencionado anteriormente) para eliminar la expresión. Además, cuando se usan queratinocitos o piel, que sólo pueden injertarse de manera bidimensional, la cantidad del injerto sólo puede aumentarse aumentando el área de superficie del injerto. Por tanto, se consideran más útiles los adipocitos, que permiten el trasplante tridimensional.

Los presentes inventores diseñaron métodos para transferir genes eficazmente en adipocitos de cultivo primario. También confirmaron que los genes transferidos funcionan tras su implantación, y encontraron que los adipocitos pueden utilizarse eficazmente en terapia génica. Además, pueden obtenerse adipocitos que expresan de manera estable el gen foráneo transferido in vivo durante un largo periodo de tiempo mediante los métodos de esta invención. Los adipocitos maduros implantados pueden seguir expresando los genes foráneos durante un año o más. Además, si la expresión del gen foráneo se vuelve innecesaria tras la implantación de los adipocitos, la expresión puede detenerse extrayendo el injerto.

La presente invención se refiere a los siguientes puntos:

1. Una composición farmacéutica que comprende un preadipocito de cultivo primario, en la que el preadipocito mantiene de manera estable un gen foráneo que codifica para una proteína que se secreta fuera de la célula y en la que el gen se ha insertado en un vector retroviral y se ha transferido a la célula mediante el vector retroviral, en la que la proteína es insulina o péptido 1 similar al glucagón (GLP-1).

2. Un preadipocito de cultivo primario, manteniendo de manera estable el preadipocito un gen foráneo que codifica para una proteína que se secreta fuera de la célula, y en el que el gen se ha insertado en un vector retroviral y se ha transferido a la célula mediante el vector retroviral, para su uso en terapia génica, en el que la proteína es insulina o GLP-1.

3. La composición farmacéutica del punto 1, o el preadipocito para su uso según el punto 2, en la que el preadipocito tiene la capacidad para expresar significativamente la proteína in vivo durante al menos 20 días.

4. La composición farmacéutica del punto 1 ó 3, o el preadipocito para su uso según el punto 2 ó 3, en la que se usa el preadipocito para liberar la proteína en el flujo sanguíneo.

5. Un método de producción in vitro de un preadipocito para su uso en terapia génica, comprendiendo el método las etapas de:

(1) Llevar a cabo un cultivo primario de un preadipocito; y

(2) transferir, y luego mantener de manera estable un gen foráneo que codifica para una proteína que se secreta fuera de la célula,

en el que la proteína es insulina o GLP-1.

6. El método del punto 5, en el que el gen foráneo se transfiere mediante un vector retroviral.

7. El preadipocito para su uso según el punto 2 que se ha producido mediante el método del punto 5 ó 6.

8. Una composición de implante, comprendiendo la composición un preadipocito de cultivo primario, que mantiene de manera estable un gen foráneo que codifica para una proteína que se secreta fuera de la célula, y en la que el gen se ha insertado en un vector retroviral y se ha transferido a la célula mediante el vector retroviral, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en terapia génica, en la que la proteína es insulina o GLP

1.

9. La composición de implante para su uso según el punto 8, o la composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4, que comprende además un componente de matriz extracelular.

10. La composición de implante para su uso según el punto 8 ó 9, o la composición farmacéutica según uno cualquiera de los puntos 1, 3, 4 y 9, que comprende además un factor de angiogénesis.

11. Un preadipocito de cultivo primario que mantiene de manera estable un gen que codifica para insulina o péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) para su uso en la disminución de la glucemia, en el que el gen se ha insertado en un vector retroviral y se ha transferido a la célula mediante el vector retroviral.

12. Un animal no humano, en cuyo organismo se ha implantado el preadipocito de cultivo primario del punto 2.

A continuación en el presente documento, se describirá el modo para llevar a cabo esta invención.

En primer lugar, la presente invención proporciona adipocitos de cultivo primario para terapia génica, en la que los adipocitos mantienen de manera estable un(os) gen(es) foráneo(s) que codifica(n) para una(s) proteína(s) que se secreta(n) al exterior de la célula.

En el presente documento, un gen foráneo se refiere a un gen de insulina o GLP-1 transferido a los adipocitos de cultivo primario desde... [Seguir leyendo]

1. Composición farmacéutica que comprende un preadipocito de cultivo primario, en la que el preadipocito mantiene de manera estable un gen foráneo que codifica para una proteína que se secreta fuera de la célula y en la que el gen se ha insertado en un vector retroviral y se ha transferido a la célula mediante el vector retroviral, en la que la proteína es insulina o péptido 1 similar al glucagón (GLP-1).

2. Preadipocito de cultivo primario, en el que el preadipocito mantiene de manera estable un gen foráneo que codifica para una proteína que se secreta fuera de la célula, y en el que el gen se ha insertado en un vector retroviral y se ha transferido a la célula mediante el vector retroviral, para su uso en terapia génica, en el que la proteína es insulina o GLP-1.

3. Composición farmacéutica de la reivindicación 1, o preadipocito para su uso según la reivindicación 2, en la que el preadipocito tiene la capacidad para expresar significativamente la proteína in vivo durante al menos 20 días.

4. Composición farmacéutica de la reivindicación 1 ó 3, o preadipocito para su uso según la reivindicación 2 ó 3, en la que el preadipocito se usa para liberar la proteína en el flujo sanguíneo.

5. Método de producción in vitro de un preadipocito para su uso en terapia génica, donde el método comprende las etapas de:

(1) llevar a cabo un cultivo primario de un preadipocito; y

(2) transferir, y después mantener de manera estable un gen foráneo que codifica para una proteína que se secreta fuera de la célula,

en el que la proteína es insulina o GLP-1.

6. Método de la reivindicación 5, en el que el gen foráneo se transfiere mediante un vector retroviral.

7. Preadipocito para su uso según la reivindicación 2 que se ha producido mediante el método de la reivindicación 5 ó 6.

8. Composición de implante, donde la composición comprende un preadipocito de cultivo primario, que mantiene de manera estable un gen foráneo que codifica para una proteína que se secreta fuera de la célula, y en la que el gen se ha insertado en un vector retroviral y se ha transferido a la célula mediante el vector retroviral, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en terapia génica, en la que la proteína es insulina o GLP

1.

9. Composición de implante para su uso según la reivindicación 8, o composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4, que comprende además un componente de matriz extracelular.

10. Composición de implante para su uso según la reivindicación 8 ó 9, o composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 y 9, que comprende además un factor de angiogénesis.

11. Preadipocito de cultivo primario que mantiene de manera estable un gen que codifica para insulina o péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) para su uso en la disminución de la glucemia, en el que el gen se ha insertado en un vector retroviral y se ha transferido a la célula mediante el vector retroviral.

12. Animal no humano, en cuyo organismo se ha implantado el preadipocito de cultivo primario de la reivindicación

2.