VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA QUE CONTIENE UN GEN PUNTA MODIFICADO.

Una vacuna para ser utilizada en la protección de las aves de corral frente a la bronquitis infecciosa,

que comprende un virus de la bronquitis infecciosa (VBI) atenuado y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, que se caracteriza porque el VBI atenuado es VBI de la cepa Beaudette que contiene un gen heterólogo de la espícula del VBI, en el que el fragmento de dicho gen heterólogo de la espícula del VBI que codifica la cola citoplásmica deriva del VBI de la cepa Beaudette receptor

Virus de la bronquitis infecciosa que contiene un gen punta modificado.

La presente invención tiene que ver con una vacuna para ser utilizada en la protección de las aves de corral frente a la bronquitis infecciosa (BI) que comprende un virus de la bronquitis infecciosa (VBI) atenuado y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, con un método para la preparación de tal vacuna y con la utilización de un VBI para la producción de una vacuna para la protección de las aves de corral frente a la BI para administración in ovo.

El VBI es un miembro del género Coronavirus, familia Coronaviridae. Tiene un genoma de ARN de hebra sencilla, de sentido positivo, de 28000 nucleótidos aproximadamente asociado con una proteína de la nucleocápsida N, rodeado por una membrana/envoltura lipídica. Otras tres proteínas víricas están asociadas con la envoltura: la glicoproteína de la espícula grande, S; una proteína de membrana integral más pequeña, M y la proteína E, la más pequeña de las proteínas asociadas a la envoltura.

La proteína S de coronavirus es una glicoproteína de tipo I que se oligomeriza en el retículo endoplásmico para formar trímeros que constituyen las espículas de los viriones de coronavirus observables mediante microscopía electrónica. La proteína S está ensamblada en las membranas del virión, posiblemente a través de interacciones no covalentes con la proteína M, pero no se requiere para la formación de partículas similares al virus coronavirus. Después de la incorporación en las partículas de coronavirus, determinada por el dominio carboxi-terminal, la glicoproteína S es responsable de la unión al receptor de la célula diana y de la fusión de las membranas vírica y celular, desempeñando una función primordial en la infección de células susceptibles. Además, la proteína de la espícula del VBI está implicada en la inducción de una respuesta inmune protectora cuando es inoculada a pollos (para una revisión ver Cavanagh, en: The Coronaviridae; ed.: S.G. Siddell, Plenum Press, 73-113, 1995).

Todas las glicoproteínas S de coronavirus constan de cuatro dominios: de una secuencia señal que es cortada durante la síntesis, el ectodominio que está presente en la parte exterior de la partícula del virión, la región transmembranal responsable del anclaje de la proteína S en la bicapa lipídica de la partícula del virión y la cola citoplásmica que podría interaccionar con otras proteínas del VBI, tales como la proteína de membrana (E) y la proteína integral de membrana (M). La glicoproteína S del VBI (1162 aminoácidos) es cortada en dos subunidades, S1 (535 aminoácidos, 90 kDa) y S2 (627 aminoácidos, 84 kDa). La subunidad S2 C-terminal se asocia no covalentemente con la subunidad S1 N-terminal y contiene el dominio transmembranal y el dominio de la cola citoplásmica C-terminal. La subunidad S1 contiene la actividad de unión al receptor de la proteína S.

En estudios previos con otros coronavirus, el virus de la hepatitis murina (VHM) y el virus de la gastroenteritis transmisible (VGET), se utilizó el gen de la espícula de una cepa vírica donante (virulenta) para sustituir al gen de la espícula de una cepa vírica receptora para investigar los determinantes de la patogénesis y el tropismo celular. Estos estudios mostraron que las propiedades in vitro (tropismo celular) y las propiedades in vivo (virulencia) de la cepa vírica donante fueron adquiridas por la cepa vírica receptora. Se concluyó que el gen de la espícula es un determinante del tropismo celular y de la virulencia (Phillips y col., J. Virol. 73, 7752-7760, 1999; Sanchez y col., J. Virol. 73, 7607-7618, 1999; Das Sarma y col., J. Virol. 74, 9206-9213, 2000; Navas y col., J. Virol. 75, 2452-2457, 2001 y Kuo y col., J. Virol. 74, 1393-1406, 2000; solicitud de patente internacional WO 01/39797). La solicitud de patente internacional WO 98/49195 describe un coronavirus (por ejemplo el VHM) en el cual una parte del gen de la proteína de la espícula ha sido sustituida por la parte correspondiente del gen de la proteína de la espícula de un coronavirus no relacionado (por ejemplo el VPIF), adquiriendo de este modo otra especificidad de sustrato celular que permite al virus recombinante dirigirse a otros tipos celulares.

La bronquitis infecciosa es una enfermedad respiratoria aguda, muy contagiosa, de las aves domésticas (pollos) causada por un virus BI. Los signos clínicos de la BI incluyen estornudos/ronroneos, crepitaciones traqueales, descarga nasal y sibilancias. Los signos clínicos son más obvios en las crías de los pollos que en las aves adultas. Las aves pueden parecer deprimidas y consumir menos alimento. Las aves para carne tienen una ganancia de peso reducida mientras que las aves ponedoras ponen menos huevos. La infección respiratoria predispone a los pollos a infecciones bacterianas secundarias que pueden ser fatales para las crías. El virus puede también producir un daño permanente en el oviducto, especialmente en las crías, dando lugar a una producción de huevos reducida y a una calidad reducida de los mismos, y en el riñón, dando lugar algunas veces a enfermedades renales que pueden ser fatales.

Las vacunas de virus vivos e inactivados son ambas utilizadas en la vacunación contra la BI. Hasta la fecha, las vacunas más eficaces son virus vivos atenuados producidos empíricamente después de pases repetidos ciegos a través de huevos embrionados hasta que se consigue un grado equilibrado deseado de atenuación e inmunogenicidad. Tales vacunas están mal definidas genéticamente y no se conoce la base molecular de la atenuación. Desgraciadamente, después de pases seriados la inmunogenicidad del virus disminuye, lo cual tiene como resultado a menudo virus vacuna seguros pero menos eficaces. El conseguir un grado "equilibrado" de atenuación - suficiente como para no ser patógeno pero no ser excesivo hasta el punto de que no produzca respuestas inmunes potentes - es un procedimiento de ensayo y error que hace que el resultado de este procedimiento de atenuación convencional sea incierto.

Según se indicó anteriormente, una de las propiedades biológicas del VBI es que se convierte en avirulento y menos inmunogénico con los pases sucesivos del virus en los embriones. La cepa Beaudette del VBI es uno de tales virus (sobre-)atenuados por los pases en embriones que se considera no inmunogénico (Geithausen y col., Arch. Gesamte Virusforsch 40, 285-290, 1973).

En una solicitud de patente recientemente publicada (WO 02/092827) se describe el desarrollo de coronavirus vivos atenuados por medio de técnicas de ADN recombinante. En la misma se sugiere que la introducción de deleciones en genes no esenciales del genoma del coronavirus tiene como resultado la atenuación de estos virus.

El VBI presenta una gran variación antigénica, reconocida inicialmente como serotipos diferentes. La clasificación de cepas serotípicas de las cepas del VBI está basada en la capacidad de una cepa para inducir anticuerpos neutralizantes del virus eficaces contra otra cepa (Cook y col., Avian Pathol. 13, 733-741, 1984). La proteína más variable del VBI es la proteína de la espícula. La misma define el serotipo y es el inductor principal de las respuestas inmunes protectoras. Un virus vacuna VBI de un serotipo induce respuestas inmunes que protegen a menudo poco frente a VBI de otros serotipos, debido a las diferencias en las proteínas S. Por consiguiente, se han desarrollado vacunas contra la BI frente a muchos serotipos. Sin embargo, serotipos previamente desconocidos están apareciendo continuamente creando el requisito de nuevos virus vacuna homólogos.

Las vacunas de VBI vivos son normalmente administradas a pollos eclosionados. La administración puede ser individualmente por medio de gotas oculares o intranasalmente, pero estas vías son caras debido al trabajo necesario para su administración, en particular en bandadas de pollos de engorde grandes. Los métodos de aplicación en masa, incluyendo la pulverización y el agua de bebida, son también utilizados frecuentemente pero se han observado problemas para conseguir una aplicación uniforme de la vacuna y la inactivación del virus vacuna.

Se ha sugerido previamente la utilización de vacunas como vacunas para embriones (denominadas vacunas in ovo) (Sharma y col., Avian Diseases 29, 1155-1169, 1985).

La vacunación in ovo, en principio, podría ser ventajosa debido a la edad temprana de resistencia a la enfermedad específica y a la administración de una dosis uniforme de vacuna en cada huevo utilizando máquinas semiautomáticas con múltiples...

1. Una vacuna para ser utilizada en la protección de las aves de corral frente a la bronquitis infecciosa, que comprende un virus de la bronquitis infecciosa (VBI) atenuado y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, que se caracteriza porque el VBI atenuado es VBI de la cepa Beaudette que contiene un gen heterólogo de la espícula del VBI, en el que el fragmento de dicho gen heterólogo de la espícula del VBI que codifica la cola citoplásmica deriva del VBI de la cepa Beaudette receptor.

2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque el gen de la espícula heterólogo codifica una proteína de la espícula de un VBI de serotipo Massachusetts.

3. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, que se caracteriza porque el gen de la espícula heterólogo codifica una proteína de la espícula del VBI de la cepa M41.

4. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque el gen de la espícula heterólogo codifica una proteína de la espícula de un VBI de serotipo 793B, en particular de un VBI de la cepa 4/91.

5. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, que se caracteriza porque el gen de la espícula heterólogo sustituye al gen de la espícula original.

6. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, que se caracteriza porque el VBI está en forma viva.

7. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-6, que se caracteriza porque la vacuna contiene además una o más cepas vacuna de otros patógenos infecciosos para las aves de corral.

8. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-7, que se caracteriza porque la vacuna contiene un adyuvante.

9. Un método para la preparación de una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, que se caracteriza porque el VBI atenuado es mezclado con un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptable.

10. Utilización del VBI de la cepa Beaudette BeauR que contiene un gen heterólogo de la espícula del VBI para la producción de una vacuna para la protección de las aves de corral frente a la bronquitis infecciosa para la administración in ovo, donde el fragmento de dicho gen heterólogo de la espícula de VBI que codifica la cola citoplásmica deriva del VBI de la cepa Beaudette BeauR receptor.