Una composición de vacuna para vacunar perros, la composición comprendiendo:

un coronavirus respiratorio canino (CRCV) que comprende una proteína Spike (S) teniendo la secuenciaaminoácida listada en la Figura 4, o

una proteína S coronaviral teniendo al menos 97% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácidade la Figura 4, o un fragmento inmunogénico de la Figura 4 de al menos 200 aminoácidos longitud, o unácido nucleico que codifica dicha proteína S coronaviral o dicho fragmento inmunogénico de la Figura 4.

La presente invención se refiere a materia biológica, y en particular a un coronavirus respiratorio canino que esta presente en perros teniendo enfermedad respiratoria infecciosa. [0002] La enfermedad respiratoria infecciosa canina (ERIC) es una enfermedad altamente contagiosa común en perros alojados en condiciones congestionadas tales como sitios de acogida y perreras de internado o entrenamiento. Muchos perros padecen únicamente una tos leve y se recuperan después de poco tiempo, sin embargo en algunos casos puede desarrolarse una bronconeumonia severa (Appel and Binn, 1987) . [0003] La patogénesis de ERIC esta considerada ser multifactorial, suponiendo varios virus y bacterias. Los agentes infecciosos considerados como los mayores patógenos causantes de ERIC son parainfluenzavirus caninos ( PIVC) (Binn et al., 1967) , adenovirus canino tipo 2 (CAV-2) (Ditchfield et al., 1962) y la bacteria Bordetella bronchiseptica (Bemis et al., 1977, Keil et al., 1998) . También, virus de herpes canino, virus reo humano y especies de micoplasma han sido aisladas de perros con síntomas de ERIC (Karpas et al., 1968, Lou and Wenner 1963, Randolph et al., 1993) Factores adicionales como el estrés pueden ser importantes. [0004] ERIC es raramente mortal pero retrasa la acogida de perros en sitios de rescate y causa trastorno de horarios en perreras de entrenamiento asi como costes considerables de tratamiento. [0005] Las vacunas están disponibles contra algunos de los agentes infecciosos asociados con la enfermedad, concretamente Bordetella bronchiseptica asi como CPIV y CAV-2. Sin embargo, a pesar del uso de estas vacunas, ERIC es todavía prevalente en perreras por todo el mundo, lo cual es posiblemente debido a las vacunas que no proporcionan protección contra todos lo agentes infecciosos involucrados en ERIC. [0006] Hemos descubierto un coronavirus novedoso, que hemos llamado coronavirus respiratorio canino (CRCV ) , en una población grande de perros en perreras con un historial de enfermedad respiratoria endémica, y hemos mostrado que este virus está asociado con ERIC. [0007] Se conoce que algunos miembros de la familia coronaviridae causan enfermedad respiratoria en humanos, ganado bovino, aves de corral y ganado porcino (Mäkelä et al., 1998, Pensaert et al., 1986, Ignjatovic and Sapats 2000) . Por ejemplo, el coronavirus respiratorio bovino está asociado con la fiebre de embarque en ganado que es una enfermedad respiratoria multifactorial (Storz et al., 2000) . [0008] Sin embargo, no se sospechaba que el coronavirus, tenía un papel en la patogénesis de ERIC. En efecto, con únicamente una excepción, los coronavirus han sido declarados ser virus entéricos y causar diarrea aguda principalmente en perros jóvenes (por ejemplo, Tennant et al., 1993) . En un gran estudio de virus involucrados en enfermedades respiratorias caninas, Binn et al. (1979) declaró la detección de un coronavirus canino en el pulmón de un solo perro que está también infectado de SV5 y adenovirus canino 2, otros dos virus que están asociados con enfermedad respiratoria canina. [0009] Existen de 30-40 vacunas de perro comercialmente disponibles en el Reino Unido para usar contra un número de patógenos que pueden causar una gama de enfermedades, tales como enfermedades neurológicas, entéricas, hepáticas y respiratorias. La mayoria de las vacunas contienen agentes microbianos tales como el virus moquillo, el Adenovirus-2 Canino, parvovirus canino, virus parainfluenza canino y Leptospira canicola y L. icterohaemorrhagiae. Ninguna de estas vacunas contiene coronavirus caninos. [0010] Las vacunas de perro para uso contra enfermedades respiratorias caninas son comercializadas como vacunas "tos de perrera " (ver abajo) . Todas las vacunas contienen Bordetella bronchisepticum, que es una bacteria asociada con "tos de perrera". [0011] Coyne M.J. & May S.W., (1995) en su articulo titulado "Considerations in using a canine coronavirus vaccine" (publicado como un Boletín Técnico de Pfizer en Internet http://www.pfizer.com/ah/vet/tref/trbull/ ccv.html) , lista alrededor de 20 vacunas disponibles comercialmente contra bien coronavirus caninos solos o contra virus caninos juntos con otros organismos. Cada una de estas vacunas es para la enfermedad entérica canina, y no hay sugerencia de que un coronavirus canino puede estar asociado con la enfermedad respiratoria. [0012] Las patentes Estadounidenses Nº 6, 057, 436 y 6, 372, 224, ambas a Miller et al y asignadas a Pfizer, Inc., describen el gen Spike del coronavirus canino entérico y usos para el mismo, incluyendo su uso como una vacuna contra la gastroenteritis. Ninguna de esas patentes sugiere que un coronavirus canino puede estar involucrado en ERIC. [0013] Miembros de la familia de coronaviridae son virus envueltos, de 80-160nm de diametro, conteniendo un genoma ARN lineal de cepa positiva. Las proteínas estructurales de coronavirus son la glucoproteína Spike (S) , la glucoproteína de membrana (M) y la proteína nucleocápsida (N) . La glucoproteína hemaglutinina/esterasa (HE) es hallada únicamente sobre la superficie de coronavirus de grupo II (por ejemplo coronavirus bovino y virus de hepatitis de ratón) (Spaan et al, 1988) . Más detalles de la estructura de coronavirus pueden ser encontrados en el capitulo por Cavanagh et al titulado "Coronviridae" p407-411, en "Virus Taxonomy, 6th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses", pub. Springer-Verlag Wein, New York, Eds. Murphy et al, que es incorporado aquí por referencia.. [0014] El coronavirus respiratorio canino (CRCV) de la invención puede estar caracterizado por un coronavirus presente en los tractos respiratorios de perros con enfermedad respiratoria infecciosa. Para caracterizar más CRCV, hemos determinado la secuencia de 250 residuos nucleótidos de la polimerasa de CRCV (pol) ADNc (Figura 1) lo cual corresponde a una secuencia parcial aminoácida 83 de la proteína de pol. (Figura 2) . Hemos clonado también y determinado la secuencia de los 4092 residuos nucleótidos Spike CRCV (S) ADNc (Figura 3) , correspondiendo a 1363 aminoácidos (Figura 4) . También hemos determinado la secuencia de 497 residuos nucleótidos del gen de CRCV hemaglutinina/esterasa (HE) (Figura 13) , correspondientes a 165 aminoácidos (Figura 14) . Hemos identificado que el CRCV tiene una homología sorprendentemente inferior al coronavirus canino entérico (CCV) mientras que tiene un nivel inesperadamente elevado de homología con el coronavirus bovino (cepa LY138 o Quebec) y coronavirus humano (cepa OC43) . [0015] Un cultivo de "CRCV Spike D-1 ", que es XL1-Blue E. coli (Stratagene) conteniendo un plásmido pT7Blue2 (Novagen) cuyo inserto contiene una porción del ADNc Spike de CRCV, ha sido depositada bajo el Tratado de Budapest en NCIMB Ltd bajo el número de Registro NCIMB 41146 el 25 de Julio de 2002. El depositante de NCIMB 41146 es el Royal Veterinar y College, Royal College Street, London NW1 OTU, UK. La dirección de NCIMB Ltd es 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB24 3RY, UK.

La relación filogenética del CRCV con once conocidos coronavirus fue determinada basada sobre una comparación de la secuencia de 250 nucleótidos del gen pol de CRCV y las regiónes correspondientes de los otros virus (Figura 5) . El coronavirus bovino (BCV) , cepa OC43 del coronavirus humano (HCV) y virus de encefalomielitis hemoglutinante ( HEV) fueron hallados estar más cercanamente relacionados al CRCV, mientras que el CCV entérico fue hallado estar únicamente lejanamente relacionado con el CRCV. [0017] Alrededor de los 250 residuos secuenciados del ADNc de pol, correspondientes a 83 aminoácidos, el CRCV únicamente tiene el 68.5% y el 75.9% de indentidad secuencial en los niveles de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente, con la región equivalente del CCV entérico (cepa 1-71) gen pol (Genbank Nº Registro. AF124986) , como se muestra en las Figuras 6 y 7. [0018] Alrededor de 4092 residuos nucleótidos secuenciados del gen de S CRCV, corresponden a 1363 aminoácidos, el CRCV tiene el 45% y el 21.2% de identidad de secuencia en el nucleótido (Figura 8) y niveles de aminoácido, respectivamente, con la región equivalente del gen de S de CCV entérico (cepa 1-71) . [0019] El CCV no es un coronavirus de grupo II y no posee un gen HE, de ahí que no es posible determinar la extensión de la identidad de la secuencia entre este gen en CRCV y en el CCV entérico. [0020] Excepto como se describe abajo, la identidad de porcentaje entre dos secuencias nucleótidas o dos secuencias aminoácidas estaba determinada usando la version 34 de FASTA (Pearson WR. (1990) "Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA". Methods Enzymol.;183:63-98) . Las caracteristicas FASTA eran Penalización de apertura de Gap -16 y Penalización de extensión de Gap -4. [0021] La... [Seguir leyendo]

1. Una composición de vacuna para vacunar perros, la composición comprendiendo: un coronavirus respiratorio canino (CRCV) que comprende una proteína Spike (S) teniendo la secuencia aminoácida listada en la Figura 4, o una proteína S coronaviral teniendo al menos 97% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Figura 4, o un fragmento inmunogénico de la Figura 4 de al menos 200 aminoácidos longitud, o un ácido nucleico que codifica dicha proteína S coronaviral o dicho fragmento inmunogénico de la Figura 4.

2. Una composición de vacuna según la Reivindicación 1 en la que la proteína S coronaviral tiene al menos 98% de identidad con la secuencia aminoácida de la Figura 4.

3. Una composición de vacuna según la Reivindicación 2 en la que la proteína S coronaviral tiene al menos 99% de identidad con la secuencia aminoácida de la Figura 4.

4. Un composición de vacuna según cualquiera de las Reivindicaciones 1-3 en donde la proteína S coronaviral es una proteína aislada o recombinante.

5. Una composición de vacuna según cualquiera de las Reivindicaciones 1-4 y también comprendiendo un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

6. Una composición de vacuna según cualquiera de las Reivindicaciones 1-5, además comprendiendo uno

cualquiera o más de: un agente capaz de aumentar una respuesta inmune en un perro contra el virus parainfluenza canino; un agente capaz de aumentar una respuesta inmune en un perro contra el tipo 2 de virus adeno canino; un agente capaz de aumentar una respuesta inmune en un perro contra virus de herpes canino; y un agente capaz de aumentar una respuesta inmune en un perro contra Bordetella bronchiseptica.

7. Una proteína S de coronavirus teniendo al menos 97% de identidad de secuencia aminoácida con la secuencia listada en la Figura 4 para uso en medicina.

8. Una proteína S de coronavirus para uso según la Reivindicación 7 que es una proteína recombinante o aislada.

9. Uso de un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 90% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Fig. 4 o una proteína S coronaviral teniendo al menos 90% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Figura 4 o un fragmento inmunogénico de la misma, o un ácido nucleico que codifica dicha proteína S coronaviral o dicho fragmento inmunogénico de la misma, en la preparación de un medicamento para estimular una respuesta inmune contra el coronavirus respiratorio canino en un perro.

10. El uso de un coronavirus teniendo una proteína S con al menos 90% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Fig. 4 o una proteína S coronaviral teniendo al menos 90% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Fig. 4, o un fragmento inmunogénico de la misma, o un ácido nucleico que codifica dicha proteína S coronaviral o dicho fragmento inmunogénico de la misma, en la preparación de un medicamento para profilaxis de enfermedad respiratoria en un perro.

11. El uso según la Reivindicación 9 o 10 en donde el coronavirus comprende una proteína S teniendo al menos 95% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Fig. 4.

12. El uso según la Reivindicación 11 en donde el coronavirus es CRCV que comprende una proteína S teniendo la secuencia aminoácida de la Fig. 4.

13. El uso según la Reivindicación 9 o 10 en donde la proteína S coronaviral tiene al menos 95% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Fig. 4.

14. El uso según la Reivindicación 13 en donde la proteína S coronaviral tiene al menos 97% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Fig. 4.

15. El uso según cualquiera de las Reivindicaciones 9-10 y 13-14 en donde la proteína S coronaviral comprende al menos uno de V en la posición 103; V en la posición 118; D en la posición 166; M en la posición 171; K en la posición 179; P en la posición 192; S en la posición 210; H en la posición 235; F en la posición 267; F en la posición 388; M en la posición 407; S en la posición 436; I en la posición 440; I en la posición 447; F en la posición 501; Y en la posición 525; N en la posición 528; L en la posición 540; K en la posición 582; G en la posición 608; G en la posición 692; S en la posición 695; W en la posición 757; G en la posición 758; Q en la posición 763; T en la posición 769; P en la posición 786; H en la posición 792; R en la posición 818; P en la posición 827; V en la posición 828; F en la posición 887; D en la posición 933; F en la posición 977; T en la posición 1011; S en la posición 1018; K en la posición 1063; L en la posición 1256; y M en la posición 1257.

16. El uso según cualquiera de las Reivindicaciones 9-10 y 13-15 en donde la proteína S coronaviral comprende la secuencia aminoácida de la Figura 4.

17. El uso según las Reivindicaciones 9-10 y 13-16 en donde la proteína S coronaviral en una proteína aislada o recombinante.

18. Una composición de vacuna según cualquiera de las 1. 5 o 6, en donde el coronavirus ha sido atenuado o inactivado.

19. Un uso según cualquiera de las Reivindicaciones 9-12, en donde el coronavirus ha sido atenuado o inactivado.

20. Una composición comprendiendo un coronavirus que tiene una proteína S con al menos 90% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Figura 4, o una proteína S coronaviral teniendo al menos 90% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Figura 4, o un fragmento inmunogénico de la misma, o un ácido nucleico que codifica dicha proteína S coronaviral o dicho fragmento inmunogénico de la misma, para uso para estimular una respuesta inmune contra el coronavirus respiratorio canino en un perro, o para uso en profilaxis de enfermedad respiratoria en un perro.

21. Una composición para uso según la Reivindicación 20 en donde el coronavirus comprende una proteína S teniendo al menos 95% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Figura 4.

22. Una composición para uso según la Reivindicación 21 en donde el coronavirus es CRCV que comprende una proteína S que tiene la secuencia aminoácida de la Figura 4.

23. Una composición para uso según cualquiera de las Reivindicacione.

2. 22 en donde el coronavirus ha sido atenuado o inactivado.

24. Una composición para uso según la Reivindicación 20 en donde la proteína coronaviral tiene al menos 95% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Figura 4.

25. Una composición para uso según la Reivindicación 24 en donde la proteína S coronaviral tiene al menos 97% de identidad aminoácida con la secuencia aminoácida de la Figura 4.

26. Una composición para uso según cualquiera de las Reivindicaciones 20, 24 y 25 en donde la proteína S coronaviral comprende al menos uno de V en la posición 103; V en la posición 118; D en la posición 166; M en la posición 171; K en la posición 179; P en la posición 192; S en la posición 210; H en la posición 235; F en la posición 267; F en la posición 388; M en la posición 407; S en la posición 436; I en la posición 440; I en la posición 447; F en la posición 501; Y en la posición 525; N en la posición 528; L en la posición 540; K en la posición 582; G en la posición 608; G en la posición 692; S en la posición 695; W en la posición 757; G en la posición 758; Q en la posición 763; T en la posición 769; P en la posición 786; H en la posición 792; R en la posición 818; P en la posición 827; V en la posición 828; F en la posición 887; D en la posición 933; F en la posición 977; T en la posición 1011; S en la posición 1018; K en la posición 1063; L en la posición 1256; y M en la posición 1257.

27. Una composición para uso según cualquiera de las Reivindicaciones 20 .

2. 26 en donde la proteína S coronaviral comprende la secuencia aminoácida de la Figura 4.

28. Una composición para uso según cualquiera de las Reivindicaciones 20 .

2. 27 en donde la proteína S coronaviral es una proteína aislada o recombinante.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Este listado de referencias citadas por el solicitante tiene como único fin la conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aunque se ha puesto gran cuidado en la compilación de las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza cualquier responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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• US 6372224 A, Miller [0012]

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