Procedimiento para obtener la expresión, o para mejorar la tasa de expresión, de un gen.

Procedimiento de sustitución de un gen, mediante administración dirigida de un ADN,

denominado ADN de inserción, constituido por una parte de un gen, susceptible de volverse funcional o más eficaz cuando se recombina con un ADN de complemento para proporcionar entonces un gen recombinante completo en el genoma de una célula eucariota, comprendiendo dicho procedimiento:

- la introducción en unas células eucariotas que no son ni células germinales humanas, ni células embrionarias humanas, de un vector que contiene una inserción que comprende a su vez el ADN de inserción, y dos secuencias denominadas "flanqueantes" a ambos lados del ADN de inserción, respectivamente homólogas a dos secuencias genómicas que lindan con el sitio de inserción deseado en un gen seleccionado, denominado gen receptor y que contiene el ADN de complemento;

- comprendiendo el ADN de inserción una parte de un gen, y siendo heterólogo con respecto al gen receptor; 15 - siendo las secuencias flanqueantes seleccionadas para permitir por recombinación homóloga, la expresión del ADN de inserción bajo el control de secuencias reguladoras del gen endógeno en el que se realiza la inserción; - no codificando dicho gen recombinante para un producto de expresión que permite la selección de los 20 transformantes.

Procedimiento para obtener la expresión, o para mejorar la tasa de expresión, de un gen.

La invención se refiere a un procedimiento de sustitución específica de una copia de un gen presente en el genoma de un organismo eucariota receptor que no es un embrión humano mediante la integración de un gen diferente del gen inactivado. Preferentemente, el gen receptor estará presente en por lo menos 2 ejemplares en la célula huésped transfectada. El gen receptor se define como el gen en el que se realizará la inserción del gen diferente.

Más particularmente, la invención se refiere a la producción de animales transgénicos no humanos en los cuales el gen extraño se ha introducido de forma localizada para permitir a la vez el mantenimiento de las funciones genéticas normales del animal y la expresión del gen extraño bajo el control de promotores endógenos.

Por "gen diferente o extraño" se entiende cualquier secuencia nucleotídica que corresponda a la totalidad o a una parte de un gen "extraño o diferente" del gen receptor, tal como se encuentra normalmente en el genoma (ARN o ADN) , o corresponde asimismo a una secuencia modificada artificialmente del gen normal o incluso a un fragmento de dicha secuencia.

La invención se refiere asimismo al procedimiento de producción de estos animales transgénicos no humanos.

En la producción de animales transgénicos, los métodos convencionales utilizados para la introducción de secuencias de ADN heterólogas en la progenie celular germinal, no permiten controlar el sitio de integración del gen extraño en el genoma, ni el número de copias introducido de esta forma. La integración del gen extraño se realiza al azar y, en general, varias copias del gen se integran a la vez, a veces en forma de tándem cabeza-cola, variando el sitio de integración y el número de copias integradas de un animal transgénico a otro.

Puede, por lo tanto, darse el caso de que genes celulares endógenos, situados en el punto de inserción se inactiven de esta manera, sin que esto se detecte fácilmente debido a las numerosas inserciones al azar. Si el producto de dichos genes es importante para el desarrollo del animal, éste se alterará de forma importante. Por otra parte, la inserción aleatoria del gen extraño puede realizarse en un sitio que no sea apropiado para la expresión del gen. Además, el hecho de que varíe el sitio y el número de inserciones de animal en animal, hace que la interpretación de los estudios de expresión resulte extremadamente difícil.

Un problema importante que se presenta en la producción de animales transgénicos es la obtención de la expresión del gen extraño. De forma general, se han llevado a cabo dos tipos de experimentos en los ratones.

Los genes introducidos en la progenie germinal son:

- o bien genes "completos", que comprenden secuencias codificadoras flanqueadas por sus propias secuencias reguladoras;

- o bien genes compuestos, formados por la secuencia codificadora de un gen fusionada con la secuencia promotora de otro gen, perteneciendo incluso los dos fragmentos a veces a dos especies animales distintas.

Se ha podido de esta forma confirmar que la especificidad de la expresión de los genes en tal o cual tejido está determinada por su (s) secuencias (s) reguladoras.

La elección del promotor apropiado para la expresión del gen extraño en el animal transgénico posee, por tanto, una importancia primordial.

Por otra parte, la mutagénesis dirigida de genes murinos en células embrionarias se ha llevado a cabo recientemente apelando a una técnica de "administración genética dirigida" (gene targeting) (Thomas et al., 1987; Doetschman et al., 1988; Thompson et al., 1989) .

En los dos primeros casos, el gen murino HPRT ha sufrido una mutación mediante inserción y reemplazamiento y, en el 3er y 4º caso, se ha corregido un gen HPRT mutado. Thomson et al han ampliado sus experiencias hasta la obtención de ratones quiméricos y han constatado el paso de la modificación genética a la progenie celular germinal.

En cada uno de los documentos citados, el sitio preciso de la integración se ha realizado de forma dirigida mediante recombinación homóloga entre, por una parte, las secuencias exógenas que incluyen la mutación o corrección incluidas en un vector bajo el control de un promotor exógeno, y, por otra parte, su homólogo genómico. Siendo así, es preciso subrayar que los autores anteriores han llevado a cabo sus experimentos en un gen específico (HPRT) , cuya activación o inactivación mediante mutación se acompañaba de un fenotipo detectable. La mutación dirigida descrita por Thomas et al. tenía como efecto inactivar el gen HPRT y, en consecuencia, hacer desaparecer el fenotipo detectable normalmente asociado con el HPRT. El gen de selección NeoR, bajo el control de un promotor TK, se incorporaba por lo tanto al ADN de inserción para permitir la selección de los transformantes. Hay que señalar que los experimentos descritos en la técnica anterior implicaban una selección, bien por el gen receptor (por ejemplo HPRT) , o bien por el gen de inserción (por ejemplo, NeoR) . El sitio de inserción y/o el tipo de gen insertado está por tanto limitado a los genes que confieren un carácter seleccionable, una selección directa.

Además, en la técnica anterior, las secuencias exógenas en el vector sirven por tanto a la vez para dirigir el sitio de integración y para introducir la modificación. A consecuencia de la recombinación homóloga, el gen modificado se encuentra siempre en su entorno genético normal.

Recordemos que un problema que se plantea durante la producción de animales transgénicos es el peligro de inactivar un gen celular endógeno que se encuentre en el punto de inserción del gen extraño.

Según la función del producto del gen inactivado, dicha inactivación puede conducir a alteraciones fisiológicas o morfológicas importantes en el animal transgénico, o bien podría incluso impedir su supervivencia.

En cambio, la inactivación de un gen podría considerarse como ventajoso si el gen en cuestión codificara para un receptor vírico u otro agente infeccioso.

Los inventores han estudiado la posibilidad de evitar los inconvenientes descritos anteriormente y asociados, en ciertos casos, a la posible inactivación de uno o varios genes celulares endógenos de función importante durante la producción de animales transgénicos no humanos.

La invención tiene por objeto un procedimiento de sustitución de un gen, especialmente mediante administración dirigida de un ADN, denominado ADN de inserción, constituido por una parte de un gen, susceptible de volverse funcional, o cuyo funcionamiento pueda volverse más eficaz, cuando se recombina con un ADN de complemento para poder entonces producir un gen recombinante completo en el genoma de una célula eucariota, caracterizado porque

- el sitio de inserción se encuentra en un gen seleccionado, denominado gen receptor, y que contiene el ADN de complemento, y porque

- se transfectan células eucariotas que no son ni células germinales humanas, ni células embrionarias humanas, con un vector que contiene una inserción que comprende a su vez el ADN de inserción y dos secuencias denominadas "flanqueadoras", a ambos lados del ADN de inserción, homólogas respectivamente a dos secuencias genómicas que lindan con el sitio de inserción deseado en el gen receptor,

- comprendiendo el ADN de inserción una parte de un gen y siendo heterólogo con respecto al gen receptor, y

- siendo las secuencias flanqueadoras seleccionadas con el fin de permitir, mediante recombinación homóloga con secuencias correspondientes del gen receptor, la expresión del ADN de inserción bajo el control de secuencias reguladoras del gen endógeno en el que se realiza la inserción y la reconstitución de un gen recombinante completo en el genoma de la célula eucariota, no codificando dicho gen recombinante para un producto de expresión que permite la selección de los transformantes.

Según el procedimiento de la invención, dicho ADN de inserción puede contener o bien una secuencia codificante o bien una secuencia reguladora, estando entonces el procedimiento caracterizado porque:

- el sitio de inserción se encuentra en un gen seleccionado denominado gen receptor y porque

- se transfectan células eucariotas con un vector que contiene una inserción que comprende a su vez el ADN de inserción y dos secuencias denominadas "flanqueantes" a... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de sustitución de un gen, mediante administración dirigida de un ADN, denominado ADN de inserción, constituido por una parte de un gen, susceptible de volverse funcional o más eficaz cuando se recombina con un ADN de complemento para proporcionar entonces un gen recombinante completo en el genoma de una célula eucariota, comprendiendo dicho procedimiento:

- la introducción en unas células eucariotas que no son ni células germinales humanas, ni células embrionarias humanas, de un vector que contiene una inserción que comprende a su vez el ADN de inserción, y dos

secuencias denominadas "flanqueantes" a ambos lados del ADN de inserción, respectivamente homólogas a dos secuencias genómicas que lindan con el sitio de inserción deseado en un gen seleccionado, denominado gen receptor y que contiene el ADN de complemento;

- comprendiendo el ADN de inserción una parte de un gen, y siendo heterólogo con respecto al gen receptor; 15

- siendo las secuencias flanqueantes seleccionadas para permitir por recombinación homóloga, la expresión del ADN de inserción bajo el control de secuencias reguladoras del gen endógeno en el que se realiza la inserción;

- no codificando dicho gen recombinante para un producto de expresión que permite la selección de los 20 transformantes.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ADN de inserción comprende una secuencia codificadora y una secuencia reguladora.

25 3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el gen receptor es un gen que normalmente no está transcrito en la célula eucariota.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el gen receptor no presenta ningún fenotipo para seleccionar.

30 5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ADN de inserción sustituye una parte de la fase codificadora del gen receptor.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las secuencias flanqueadoras son de tamaño importante, preferentemente inferior a la longitud del gen receptor. 35

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el gen de inserción es un gen que codifica para un receptor.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el vector comprende unas

secuencias intercaladas entre el ADN de inserción y las secuencias flanqueadoras, por ejemplo unas secuencias que permiten la clonación de un vector.

9. Célula eucariota recombinada, capaz de expresar un gen o una parte de un gen, siendo dicha célula susceptible de ser producida según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 45

10. Procedimiento de producción de animales transgénicos no humanos, que comprende la realización de un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la inserción del ADN de inserción se lleva a cabo en un huevo no humano en el estado unicelular.

50 11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dichos animales son mamíferos.

12. Animal transgénico no humano susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento según la reivindicación 10.

55 13. Animal según la reivindicación 12, en el que dicho animal es un ratón.

14. Animal según la reivindicación 12, en el que el gen receptor permanece inactivo hasta un estadio más avanzado del desarrollo del animal.