Variante de proteasa, que es una variante de una proteasa precursora de subtilisina de Bacillus lentus que tiene la secuencia mostrada en la figura 3,

estando dicha variante caracterizada por tener la misma carga electrostática neta a pH 7 o el mismo punto isoeléctrico que dicha proteasa precursora, y comprender una secuencia de aminoácidos que tiene las sustituciones R170SA1R, R170S-G61R, R170S-N204R, R170S-S216R o R170S-G100R en relación a dicha proteasa precursora, donde las posiciones de dichas sustituciones son equivalentes a las posiciones especificadas en la subtilisina madura de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la figura 3

Variantes de proteasas con múltiples sustituciones.

Antecedentes de la invención

Las serín proteasas son un subgrupo de carbonil hidrolasas. Comprenden una clase diversa de enzimas que tienen un amplio rango de especificidades y funciones biológicas. Stroud, R. Sci. Amer., 131: 74-88. A pesar de su diversidad funcional, la maquinaria catalítica de las serín proteasas se ha aproximado mediante por lo menos dos familias de enzimas genéticamente diferentes: 1) las subtilisinas y 2) las serín proteasas bacterianas homológas y relacionadas con la quimiotripsina de mamífero (por ejemplo, tripsina y tripsina de S. gresius). Estas dos familias de serín proteasas muestran mecanismos destacadamente similares de catalizadores. Kraut, J. (1977), Annu. Rev. Biochem., 46: 331-358. Además, aunque la estructura primaria no esté relacionada, la estructura terciaria de estas dos familias de enzimas reunirá una triada catalítica conservada de aminoácidos que consisten en serina, histidina y aspartato.

Las subtilisinas son serín proteasas (aproximadamente PM 27.500) que se secretan en grandes cantidades a partir de una amplia variedad de especies de Bacillus y otros microorganismos. La secuencia de proteínas de subtilisina se ha determinado a partir de por lo menos nueve especies diferentes de Bacillus. Markland, F.S., et al. (1983), Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364:1537-1540. Se ha descrito la estructura cristalográfica tridimensional de subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniforimis y varias variantes naturales de B. lentus. Estos estudios indican que aunque la subtilisina no está genéticamente relacionada con las serín proteasas de mamífero, tiene una estructura similar en el sitio activo. Las estructuras de cristales por rayos X que contenían inhibidores de péptido unidos covalentemente (Robertus, J.D., et al. (1972), Biochemistry, 11: 2439-2449) o complejos de productos (Robertus, J.D., et al. (1976), J. Biol. Chem., 251: 1097-1103) también han proporcionado información con respecto al sitio activo y al supuesto hueco de unión al sustrato de la subtilisina. Además, se han descrito un gran número de estudios de modificaciones cinéticas y químicas para la subtilisina; Svendsen, B. (1976), Carlsberg Res. Commun., 41: 237-291; Markland, F.S. Id.), así como por lo menos un informe en el que la cadena lateral de metionina en el residuo 222 de subtilisina se convertía mediante peróxido de hidrógeno en metionin-sulfóxido (Stauffer, D.C., et al. (1965), J. Biol. Chem., 244: 5333-5338) y se han llevado a cabo mutagénesis específicas de sitio (Wells y Estell (1988) TIBS 13: 291-297). WO98/55634, WO99/20727 y WO99/20770 describen todos variantes de subtilisina que presentan sustituciones en varias combinaciones de posiciones. La variante descrita se puede utilizar (por ejemplo) en composiciones de limpieza.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona una variante de proteasa, que es una variante de una proteasa precursora de subtilisina de Bacillus lentus que presenta la secuencia mostrada en la figura 3, estando dicha variante caracterizada por tener la misma carga electrostática neta a pH 7 o el mismo punto isoeléctrico que dicha proteasa precursora, y que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la sustituciones R170S-A1R, R170S-G61R, R170S-N204R, R170S-S216R o R170S-G100R en relación a dicha proteasa precursora, donde las posiciones de dichas sustituciones son equivalentes a las posiciones especificadas en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura mostrada en la figura 1.

La presente invención proporciona además ADN que codifica dicha variante de proteasa, así como un vector de expresión que comprende dicha secuencia de ADN y una célula huésped transformada con dicho vector de expresión.

La presente invención proporciona además una composición de limpieza que comprende la variante de proteasa descrita anteriormente.

La presente invención también proporciona un método de mejor rendimiento de lavado de una proteasa precursora de subtilisina de Bacillus lentus que tiene la secuencia mostrada en la figura 3, que comprende la introducción de las sustituciones R170S-A1R, R170S-G61R, R170S-N204R, R170S-S216R o R170S-G100R en dicha proteasa precursora para producir una variante de proteasa, donde dicha variante de proteasa tiene la misma carga electrostática neta a pH 7 o el mismo punto isoeléctrico que dicha proteasa precursora, y donde dicha variante de proteasa tiene una mejor rendimiento de lavado en relación a dicha proteasa precursora, donde las posiciones de dichas sustituciones son equivalentes a las posiciones especificadas en la subtilisina madura de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la figura 1.

El método puede comprender modificar una secuencia de ADN que codifica dicha proteasa precursora para producir una secuencia de ADN modificada que codifica la variante de proteasa. Puede comprender además transformar una célula huésped con un vector que contiene la secuencia de ADN modificada y que expresa la variante de proteasa a partir de la célula huésped transformada.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-C representan las secuencias de AND (SEC ID No. 1) y aminoácidos (SEC ID No. 2) para subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y un mapa de restricción parcial de este gen.

La figura 2 representa los residuos de aminoácidos conservados entre subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (BPN)' y Bacillus lentus (tipo salvaje).

Las figuras 3A y 3B representan la secuencia de aminoácido de cuatro subtilisinas. La línea superior representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (a veces referida como subtilisina BPN') (SEC ID NO: 3). La segunda línea representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacillus subtilis (SEC ID NO: 4). La tercera línea representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de B. licheniformis (SEC ID NO: 5). La cuarta línea representa la secuencia de aminoácidos de subtilisina de Bacillus lentus (también referida como subtilisina 309 en la PCT WO89/06276) (SEC ID NO: 6). El símbolo * indica la ausencia de residuos de aminoácidos específicos en comparación con la subtilisina BPN'.

La figura 4 representa el vector de expresión de B. Subtilis pVS08.

La figura 5 representa la orientación del cebador ApaI directo, el cebador ApaI inverso, el cebador mutagénico inverso y el cebador mutagénico directo.

Descripción detallada de la invención

Las proteasas son carbonil hidrolasas que actúan en general para dividir enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Tal como se utiliza en la presente invención, proteasa significa una proteasa natural o una proteasa recombinante. Las proteasas naturales incluyen una a-aminoaceil péptido hidrolada, peptidilaminoácido hidrolasa, acilamino hidrolasa, serín carboxipeptidasa, metalocarboxipeptidasa, tiol proteinasa, carboxil-proteinasa y metaloproteinasa. Se incluyen serín, metalo, tiol y ácido proteasas, sí como endo y exo proteasas.

La presente invención incluye enzimas proteasas que son variantes de carbonil hidrolasa (variantes de proteasas) no naturales que tienen una actividad proteolítica, estabilidad, especificidad de sustrato, perfil de pH y/o rendimiento diferentes característicos en comparación con la carbonil hidrolasa precursora de la que deriva la secuencia de aminoácidos de la variante. Específicamente, dichas variantes de proteasa presentan una secuencia de aminoácidos no hallada en la naturaleza, que se deriva mediante la sustitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos de una proteasa precursora con aminoácidos diferentes. La proteasa precursora puede ser una proteasa natural o una proteasa recombinante.

A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a varios aminoácidos mediante códigos de una letra y tres letras. Dichos códigos se identifican en Dale, M.W. (1989), Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Appendix B.

Las variantes de proteasas útiles en la presente invención derivan de subtilisina de Bacillus lentus.

Las subtilisinas son proteasas bacterianas o fúngicas que actúan en general para dividir enlaces peptídicos de proteínas o péptidos. Tal como se utiliza en la presente invención, subtilisina significa una subtilisina natural o una subtilisina recombinante. Se conoce que un conjunto de subtilisinas...

1. Variante de proteasa, que es una variante de una proteasa precursora de subtilisina de Bacillus lentus que tiene la secuencia mostrada en la figura 3, estando dicha variante caracterizada por tener la misma carga electrostática neta a pH 7 o el mismo punto isoeléctrico que dicha proteasa precursora, y comprender una secuencia de aminoácidos que tiene las sustituciones R170SA1R, R170S-G61R, R170S-N204R, R170S-S216R o R170S-G100R en relación a dicha proteasa precursora, donde las posiciones de dichas sustituciones son equivalentes a las posiciones especificadas en la subtilisina madura de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la figura 3.

2. ADN que codifica una variante de proteasa según la reivindicación 1.

3. Vector de expresión que comprende el ADN según la reivindicación 2.

4. Célula huésped transformada con el vector de expresión según la reivindicación 3.

5. Composición de limpieza que comprende la variante de proteasa según la reivindicación 1.

6. Método de mejora del rendimiento del lavado de una proteasa precursora de subtilisina de Bacillus lentus que tiene la secuencia mostrada en la figura 3, que comprende introducir las sustituciones R170S-A1R, R170S-G61R, R170S-N204R, R170SS216R o R170S-G100R en dicha proteasa precursora para producir una variante de proteasa, donde dicha variante de proteasa tiene la misma carga electrostática neta a pH 7 o el mismo punto isoeléctrico que dicha proteasa precursora, y donde dicha variante de proteasa mejora el rendimiento de lavado en relación a dicha proteasa precursora, donde las posiciones de dichas sustituciones son equivalentes a las posiciones especificadas en la subtilisina madura de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la figura 3.

7. Método según la reivindicación 6, que comprende modificar una secuencia de ADN que codifica dicha proteasa precursora para producir una secuencia de ADN modificada que codifica dicha variante de proteasa.

8. Método según la reivindicación 7, que comprende transformar una célula huésped con un vector que contiene dicha secuencia de ADN modificada y expresar dicha variante de proteasa a partir de la célula huésped transformada.