VARIANTES DE LIPOXIGENASA Y SU USO.
Una 9-lipoxigenasa que es:
a) un polipéptido codificado por una secuencia de ADN clonada en el plásmido pUC19 presente en Escherichia coli depositado como DSM 14139,
b) un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos como péptido maduro mostrada en la SEC ID NO:1,
c) un análogo del polipéptido definido en (a) o (b) que:
i)tiene al menos 85% homología con dicho polipéptido,
ii)es una variante alélica de dicho polipéptido, o
d) un polipéptido codificado por ADN que se hibridiza en condiciones de astringencia alta con una cadena complementaria de
i)la secuencia de ADN clonada en el plásmido pUC19 presente en Escherichia coli depositada como DSM 14139 o
ii)la secuencia de ADN de SEC ID NO:1 codificante del polipéptido maduro
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DK02/00251.
Solicitante: NOVOZYMES A/S.
Nacionalidad solicitante: Dinamarca.
Dirección: KROGSHØJVEJ 36,2880 BAGSVAERD.
Inventor/es: SUGIO,AKIKO, TAKAGI,SHINOBU.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 23 de Diciembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A21D8/04B
- A23L1/305E
- C11D3/386 QUIMICA; METALURGIA. › C11 ACEITES, GRASAS, MATERIAS GRASAS O CERAS ANIMALES O VEGETALES; SUS ACIDOS GRASOS; DETERGENTES; VELAS. › C11D COMPOSICIONES DETERGENTES; UTILIZACION DE UNA SOLA SUSTANCIA COMO DETERGENTE; JABON O SU FABRICACION; JABONES DE RESINA; RECUPERACION DE LA GLICERINA. › C11D 3/00 Otros compuestos que entran en las composiciones detergentes cubiertas por C11D 1/00. › Preparaciones que contienen enzimas.
- C12N9/02K
- C12P7/64 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Grasas; Aceites; Ceras de tipo éster; Acidos grasos superiores, es decir, con una cadena lineal de al menos siete átomos de carbono unida a un grupo carboxilo; Aceites o grasas oxidadas.
Clasificación PCT:
- A21D8/04 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A21 COCCION EN HORNO; EQUIPAMIENTO PARA LA PREPARACION O EL TRATAMIENTO DE LA MASA; MASAS PARA COCER EN HORNO. › A21D TRATAMIENTO, p.ej. CONSERVACION DE LA HARINA O DE LA MASA, p.ej. POR ADICION DE INGREDIENTES; COCCION; PRODUCTOS DE PANADERIA; SU CONSERVACION. › A21D 8/00 Métodos de preparación o de cocción de la masa (tratamiento de la harina o de la masa por adición de ingredientes A21D 2/00). › tratando la masa con microorganismos o enzimas.
- C11D3/386 C11D 3/00 […] › Preparaciones que contienen enzimas.
- C12N15/53 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Oxidorreductasas (1).
- C12N9/02 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa.
- C12P7/64 C12P 7/00 […] › Grasas; Aceites; Ceras de tipo éster; Acidos grasos superiores, es decir, con una cadena lineal de al menos siete átomos de carbono unida a un grupo carboxilo; Aceites o grasas oxidadas.
Clasificación antigua:
- A21D8/04 A21D 8/00 […] › tratando la masa con microorganismos o enzimas.
- C11D3/386 C11D 3/00 […] › Preparaciones que contienen enzimas.
- C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
- C12N9/02 C12N 9/00 […] › Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa.
- C12P7/64 C12P 7/00 […] › Grasas; Aceites; Ceras de tipo éster; Acidos grasos superiores, es decir, con una cadena lineal de al menos siete átomos de carbono unida a un grupo carboxilo; Aceites o grasas oxidadas.
Fragmento de la descripción:
Variantes de lipoxigenasa y su uso.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una lipoxigenasa y a un polinucleótido que la codifica.
Antecedentes de la invención
La lipoxigenasa (EC 1.13.11.12) es una enzima que cataliza la oxigenación de ácidos grasos poliinsaturados tales como el ácido linoleico, ácido linolénico y ácido araquidónico, que contiene una unidad cis,cis-1,4-pentadieno y produce hidroperóxidos de estos ácidos grasos. La enzima es distribuida en gran parte en plantas y animales. Un número de genes de la lipoxigenasa han sido aislados a partir de varias fuentes vegetales y mamíferas.
Por otra parte, sólo un número limitado de lipoxigenasas microbianas son conocidas, y ningún gen de lipoxigenasa de origen microbiano ha sido descrito. Su and Oliw, J. Biological Chemistry, 273 (21), 13072-79 (1998) describen una lipoxigenasa de Gaeumannomyces graminis.
Resumen de la invención
Los inventores han descubierto una nueva lipoxigenasa fúngica y han determinado su secuencia, la cual puede ser usada para la producción de la enzima a escala industrial. Estos han clonado el gen en E. coli y depositado el clon.
Por consiguiente, la invención provee una lipoxigenasa que es:
La invención provee también un polinucleótido que comprende:
Otros aspectos de la invención proveen un constructo de ácido nucléico y un vector de expresión recombinante comprendiendo el polinucleótido, una célula huésped recombinante comprendiendo el constructo o el vector, y un método para producir una lipoxigenasa mediante el cultivo de la célula. Además, la invención provee un método de selección de una librería eucariótica para obtener una lipoxigenasa y una sonda de oligonucleótidos útil para la selección. Finalmente, la invención provee el uso de la lipoxigenasa en productos de cocción y en un detergente.
Descripción detallada de la invención
Fuente de ADN genómico
Un gen de lipoxigenasa de la invención puede ser derivado de un hongo filamentoso, por ejemplo un Ascomicota, particularmente Magnaporthaceae, tal como una cepa de Magnaporthe, particularmente Magnaporthe salvinii Cattaneo (Mycologia 64 (1),110 (1972)). La especie es también conocida con los sinónimos Curvularia sigmoidea, Helminthosporium sigmoideum, Leptosphaeria salvinii, Nakataea sigmoidea, Sclerotium oryzae y Vakrabeeja sigmoidea. Un ejemplo es la cepa M. salvinii IFO 6642.
De forma alternativa, el gen puede ser aislado a partir de Pyricularia, por ejemplo P. oryzae o P. grísea, por ejemplo P. oryzae IFO 30517. Las cepas IFO son distribuidas comercialmente por el Institute for Fermentation, Osaka (IFO), 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686, Japón.
El gen de lipoxigenasa puede ser aislado a partir de estos organismos usando unas sondas diseñadas en base a las secuencias de ADN en esta especificación.
Una cepa de Escherichia coli conteniendo un gen de lipoxigenasa a partir de M. salvinii IFO 6642 fue depositada por los inventores según las condiciones del Tratado de Budapest con Deutsche Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig DE, Alemania. La fecha de depósito fue el 28 de febrero de 2001, y el número de acceso era DSM 14139.
Producción de lipoxigenasa por cultivo de transformante
La lipoxigenasa de la invención puede ser producida por transformación de una célula huésped adecuada con una secuencia de ADN codificante de la lipoxigenasa, cultivo del organismo transformado en condiciones que permiten la producción de la enzima, y por recuperación de la enzima del cultivo.
El organismo huésped puede ser una célula eucariótica, en particular una célula fúngica, tal como una célula de levadura o una célula fúngica filamentosa, por ejemplo una cepa de Aspergillus, Fusarium, Trichoderma o saccharomyces, particularmente A. Niger, A. oryzae, F. graminearum, F. samb?cinum, F. cerealis o S. cerevisiae. La producción de la lipoxigenasa en estos organismos huéspedes puede ser realizada por los métodos generales descritos en EP 238,023 (Novo Nordisk), WO 96/00787 (Novo Nordisk) o EP 244,234 (Alko).
Propiedades de LOX
La lipoxigenasa de la invención es capaz de oxidar una gama amplia de sustratos que contienen una fracción cis-cis-pentadienilo. De esta manera, actúa sobre los ácidos grasos poliinsaturados tales como el ácido linoleico (18 átomos de carbono, 2 enlaces dobles), ácido linolénico (18:3), ácido araquidónico (20:4), ácido eicosapentanoico (AEP, 20:5) y ácido docosahexaenoico (ADH, 22:6). También actúa sobre ácidos grasos otros que los sustratos, tales como el linoleato de metilo y probablemente también triglicéridos. La enzima presenta una constante de Michaelis muy baja (KM) con respecto al ácido linoleico y una alta especificidad (Vmax/KM) hacia este sustrato.
La lipoxigenasa de M. salvinii es una 9-lipoxigenasa, es decir que oxida el enlace doble entre los átomos de carbono 9 y 10 en ácido linoleico y ácido linolénico.
La lipoxigenasa de M. salvinii presenta una actividad óptima alrededor de pH7, y es altamente activa por encima de una gama de pH amplia de 3-12, con más de 50% de actividad óptima en la gama de pH 6-11. Esta es estable después de toda una noche de incubación en pH 5-11.
La lipoxigenasa nativa de M. salvinii presenta una actividad óptima a 50-60ºC. Es bastante activa a 40-60ºC, y la actividad empieza a descender a 70ºC. La lipoxigenasa es estable después de 30 minutos de incubación con un pH 7 a temperaturas hasta 50ºC.
La velocidad de reacción para la lipoxigenasa recombinante (expresada en A. oryzae) aumenta casi diez veces a la temperatura óptima para una catálisis en comparación con el nivel obtenido a temperatura ambiente. La velocidad de reacción máxima es obtenida a 67.5ºC. Una reducción excesiva de la constante de nivel es detectada por encima de la temperatura óptima. Se cree que la glicosilación vuelve la enzima recombinante más estable con respecto al calor que la enzima de tipo salvaje.
La lipoxigenasa recombinante es bastante estable a temperaturas hasta 50ºC durante al menos una hora. La actividad cae en una forma lineal a temperaturas superiores entre 50-60ºC, y ninguna actividad es detectada después de incubaciones superiores a 60ºC...
Reivindicaciones:
1. Una 9-lipoxigenasa que es:
2. Lipoxigenasa según la reivindicación 1 que es derivada de un hongo filamentoso, por ejemplo un Ascomycota, tal como una cepa de Magnaporthe, particularmente M. salvinii.
3. Lipoxigenasa según la reivindicación 1 o 2, que tiene al menos 90% de homología, preferiblemente al menos 95% de homología, con el péptido maduro expuesto en la SEC ID NO:1 o con el polipéptido codificado por una secuencia de ADN clonada en el plásmido pUC19 presente en Escherichia coli depositado como DSM 14139.
4. ADN comprendiendo una secuencia de ácido nucleico que codifica la lipoxigenasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. Polinucleótido que comprende:
6. Constructo de ácido nucleico comprendiendo la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 4 o 5 enlazado operativamente a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la lipoxigenasa en un huésped de expresión adecuado.
7. Vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6, un promotor, y señales de parada transcripcionales y translacionales.
8. Célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 6 o el vector de la reivindicación 7.
9. Método para la producción de una lipoxigenasa comprendiendo el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 8 en condiciones que llevan a la producción de la lipoxigenasa, y la recuperación de la lipoxigenasa.
10. Método de preparación de una masa o de un producto horneado hecho a partir de una masa, comprendiendo la adición de la lipoxigenasa a la masa según cualquiera de reivindicaciones 1-3.
11. Composición de la masa comprendiendo la lipoxigenasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
12. Composición detergente comprendiendo un agente tensioactivo y la lipoxigenasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
13. Composición detergente de la reivindicación anterior donde el agente tensioactivo es aniónico.
14. Proceso para la oxidación de un ácido graso poliinsaturado comprendiendo la puesta en contacto del ácido con la lipoxigenasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en presencia del aire.
15. Uso del proceso de la reivindicación anterior para la síntesis de aromas con un toque verde o síntesis de hormonas vegetales.
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