VARIANTES DE BETA-GLUCOSIDASAS.
Variante aislada de una beta-glucosidasa progenitora, que comprende una sustitución a una posición correspondiente a la posición 161 de los aminoácidos 20 a 861 de SEC ID nº:
2 o correspondiente a la posición 161 de los aminoácidos 20 a 863 de SEC ID nº: 70, caracterizada por el hecho de que la variante tiene actividad de beta-glucosidasa y comprende las sustituciones G161S + Q202R + H285Q + D722G (o D724G), las sustituciones G161S + Q202R + H285Q, las sustituciones G161S + H285Q + D722G (o D724G), las sustituciones G161S + Q202R + D722G (D724G), las sustituciones G161 S + Q202R, las sustituciones G161S + H285Q o las sustituciones G161 S + D722G (o D724G) en comparación con la beta-glucosidasa progenitora
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2004/013401.
Solicitante: NOVOZYMES, INC..
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 1445 DREW AVENUE,DAVIS, CA 95616.
Inventor/es: LAMSA,MICHAEL, FIDANTSEF,ANA, GORRE-CLANCY,BRIAN.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 16 de Junio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K36/062 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 36/00 Preparaciones medicinales de constitución indeterminada que contienen sustancias procedentes de algas, líquenes, hongos o plantas o sus derivados, p. ej. medicinas tradicionales basadas en plantas. › Ascomycota.
- C12N9/42 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
- C12Q1/68M10F
Clasificación PCT:
- C07H21/04 C […] › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
- C07K14/38 C07 […] › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Aspergillus.
- C12N1/12 C12N […] › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Algas unicelulares; Sus medios de cultivo (como novedades vegetales A01H 13/00).
- C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
- C12N9/00 C12N […] › Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas.
- C12N9/24 C12N 9/00 […] › actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2).
- C12N9/42 C12N 9/00 […] › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
- C12P21/06 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados.
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Clasificación antigua:
- C07H1/00 C07H […] › Procesos para la preparación de derivados de azúcar.
Fragmento de la descripción:
Variantes de beta-glucosidasas.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a variantes de beta-glucosidasas que tienen una o más propiedades mejoradas en relación con su enzima progenitora, ácidos nucleicos que codifican las variantes, métodos para producir las variantes y métodos para usar las variantes.
La celulosa es un polímero de la glucosa de azúcar simple enlazada covalentemente por enlaces beta 1,4. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan glucanos beta enlazados. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celobiohidrolasas y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en lugares al azar, abriéndolo al ataque por parte de celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas secuencialmente liberan moléculas de celobiosa de las extremidades del polímero de celulosa. La celobiosa es un dímero de glucosa de enlace beta 1,4 hidrosoluble. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa a glucosa.
La conversión de materias primas celulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad inmediata de grandes cantidades de materia prima, la conveniencia de evitar quemar o verter en terrenos los materiales y la limpieza del combustible de etanol. La madera, los residuos agrícolas, los brotes herbáceos y los desperdicios sólidos municipales han sido considerados materias primas para la producción de etanol. Estos materiales principalmente consisten en celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez que la celulosa se convierte en glucosa, la glucosa es fácilmente fermentada por levadura en etanol. Ya que la glucosa es fácilmente fermentada a etanol por una variedad de levaduras mientras que la celobiosa no lo es, cualquier celobiosa restante al final de la hidrólisis representa una pérdida de rendimiento de etanol. De manera más importante, la celobiosa es un inhibidor potente de endoglucanasas y celobiohidrolasas. La acumulación de celobiosa durante la hidrólisis es extremadamente indeseable para la producción de etanol.
La acumulación de celobiosa ha sido un problema importante en la hidrólisis enzimática porque los microorganismos productores de celulasa producen poca beta-glucosidasa. La baja cantidad de beta-glucosidasa da como resultado una escasez de la capacidad de hidrolizar la celobiosa a glucosa. Se han utilizado diferentes enfoques para aumentar la cantidad de beta-glucosidasa en la conversión de celulosa a glucosa.
Un enfoque es producir beta-glucosidasa usando microorganismos que producen poca celulasa y añadir la beta-glucosidasa exógenamente a endoglucanasa y celobiohidrolasa para mejorar la hidrólisis. No obstante; las cantidades requeridas son demasiado costosas para una biomasa comercial para la operación de etanol.
Un segundo enfoque es llevar a cabo hidrólisis de celulosa simultáneamente con fermentación de la glucosa por levadura. Este proceso es conocido como sacarificación simultánea y fermentación (SSF). En un sistema SSF, la fermentación de la glucosa la retira de la solución. No obstante, los sistemas SSF no son aún comercialmente viables debido a que la temperatura operativa para la levadura de 28ºC es demasiado baja para las condiciones de 50ºC requeridas.
Un tercer enfoque para superar la escasez de beta-glucosidasa es sobreexpresar la beta-glucosidasa en un huésped, aumentando así el rendimiento de la beta-glucosidasa.
Sería una ventaja en la técnica proporcionar variantes de beta-glucosidasa con propiedades mejoradas para convertir materiales celulósicos a monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Las propiedades mejoradas incluyen actividad alterada dependiente de perfiles de temperatura, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad del pH, especificidad de sustrato, especificidad de producto y estabilidad química.
Es un objeto de la presente invención proporcionar variantes de beta-glucosidasas con propiedades mejoradas en comparación con sus enzimas progenitoras.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a variantes aisladas de una beta-glucosidasa progenitora tal y como se define en la reivindicación 1 anexa. Las características preferidas de las variantes están establecidas en las reivindicaciones 2 a 7 anexas.
La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos aisladas que codifican las beta-glucosidasas variantes que tienen actividad de beta-glucosidasa y a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes que comprenden las secuencias de nucleótidos.
La presente invención también se refiere a métodos para producir una variante de una beta-glucosidasa progenitora que tiene actividad de beta-glucosidasa en una célula huésped.
La presente invención también se refiere a plantas que codifican beta-glucosidasa variantes que tienen actividad de beta-glucosidasa.
La presente invención además se refiere a métodos para degradar o convertir biomasa con contenido de celulosa y hemicelulosa, tal y como se define en las reivindicaciones 13 a 16 anexas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un mapa de restricción de pSATe101.
La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pSATe111.
La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pMJ04.
La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pCaHj527.
La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pMT2188.
La Figura 6 muestra un mapa de restricción de pCaHj568.
La Figura 7 muestra un mapa de restricción de pMJ05.
La Figura 8 muestra un mapa de restricción de pSMai130.
La Figura 9 muestra la secuencia de ADNc de un gen de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (SEC ID nº: 1) y la secuencia de aminoácidos deducida del mismo (SEC ID nº: 2).
La Figura 10 muestra 63 bp de la secuencia de señal de endoglucanasa V de Humicola insolens putativa (codón de inicio ATG a Ala 21, SEC ID nº: 29).
La Figura 11 muestra un mapa de restricción de pSMai135.
La Figura 12 muestra un mapa de restricción de pALFd1.
La Figura 13 muestra un mapa de restricción de pAILo1.
La Figura 14 muestra un mapa de restricción de pBANe10.
La Figura 15 muestra un mapa de restricción de pAlLo2.
La Figura 16 muestra un mapa de restricción de pALFd3BG41.
La Figura 17 muestra un mapa de restricción de pALFd3BG48.
La Figura 18 muestra una determinación de termoestabilidad de variantes de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae BG41 y BG48.
La Figura 19 muestra los efectos de la termoestabilidad de las mutaciones G161 S y H285Q individualmente y combinadas.
La Figura 20 muestra un mapa de restricción de pEJG97.
La Figura 21 muestra la secuencia de ADN genómico y la secuencia de aminoácidos deducida de una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID nº: 69 y 70, respectivamente). El péptido señal predicho está subrayado y los intrones predichos están en cursiva.
La Figura 22 muestra un mapa de restricción de pCR4Blunt-TOPOAfcDNA5'.
La Figura 23 muestra un mapa de restricción de pCR4Blunt-TOPOAfcDNA3'.
La Figura 24 muestra un mapa de restricción de pCR4Blunt-TOPOAfcDNA.
La Figura 25 muestra un mapa de restricción de pALFd7.
La Figura 26 muestra un mapa de restricción de pALFd6.
La Figura 27 muestra un mapa de restricción de pEJG97AfumFAM3AG142S.
La Figura 28 muestra un mapa de restricción de pALFd7G142S.
La Figura 29 muestra un mapa de restricción de pEJG97AfumFAM3AH266Q.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a variantes aisladas de una beta-glucosidasa progenitora tal y como se define en la reivindicación 1 anexa.
El término "beta-glucosidasa" es definido en la presente como una glucohidrolasa de beta-D-glucósido (E.C. 3.2.1.21) que cataliza la hidrólisis de residuos de beta-D-glucosa no reductores terminales con la liberación de beta-D-glucosa. Para objetivos de la presente invención, la actividad...
Reivindicaciones:
1. Variante aislada de una beta-glucosidasa progenitora, que comprende una sustitución a una posición correspondiente a la posición 161 de los aminoácidos 20 a 861 de SEC ID nº: 2 o correspondiente a la posición 161 de los aminoácidos 20 a 863 de SEC ID nº: 70, caracterizada por el hecho de que la variante tiene actividad de beta-glucosidasa y comprende las sustituciones G161S + Q202R + H285Q + D722G (o D724G), las sustituciones G161S + Q202R + H285Q, las sustituciones G161S + H285Q + D722G (o D724G), las sustituciones G161S + Q202R + D722G (D724G), las sustituciones G161 S + Q202R, las sustituciones G161S + H285Q o las sustituciones G161 S + D722G (o D724G) en comparación con la beta-glucosidasa progenitora.
2. Variante según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que la beta-glucosidasa progenitora es (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad, preferiblemente al menos 75% de identidad, más preferiblemente al menos 80% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 85% de identidad, de forma más preferible al menos 90% de identidad, e incluso de forma más preferible al menos 95% de identidad con los aminoácidos 20 a 861 de SEC ID nº: 2 o aminoácidos 20 a 863 de la SEC ID nº: 70 o (b) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones de astringencia baja, preferiblemente condiciones de astringencia media, más preferiblemente condiciones de astringencia media alta, y de forma más preferible condiciones de astringencia alta con los nucleótidos 58 a 2583 de SEC ID nº: 1 o los nucleótidos 58 a 2589 de SEC ID nº: 71, o sus hebras complementarias.
3. Variante según la reivindicación 1 o 2, caracterizada por el hecho de que la beta-glucosidasa progenitora comprende la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 20 a 861 de SEC ID nº: 2 o aminoácidos 20 a 863 de la SEC ID nº: 70.
4. Variante según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por el hecho de que la beta-glucosidasa progenitora consiste en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 20 a 861 de SEC ID nº: 2 o aminoácidos 20 a 863 de la SEC ID nº: 70.
5. Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos 70% de identidad, preferiblemente al menos 75% de identidad, más preferiblemente al menos 80% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 85% de identidad, de forma más preferible al menos 90% de identidad, e incluso de forma más preferible al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos de la beta-glucosidasa progenitora.
6. Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene una o más propiedades mejoradas en comparación con la beta-glucosidasa progenitora, caracterizada por el hecho de que las propiedades mejoradas son seleccionadas del grupo que consiste en actividad térmica, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad de pH, especificidad del sustrato, especificidad del producto y estabilidad química.
7. Variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por el hecho de que la actividad térmica de la beta-glucosidasa variante es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, más preferiblemente al menos 5 veces, de forma más preferible al menos 7 veces, e incluso de forma más preferible al menos 20 veces más térmicamente activa que la beta-glucosidasa progenitora de la variante.
8. Secuencia de nucleótidos aislada que codifica la variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 8.
10. Vector de expresión que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 9.
11. Célula huésped que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 9.
12. Método para la producción de una variante de una beta-glucosidasa progenitora, que comprende:
13. Método para degradar o convertir biomasa con contenido de celulosa y hemicelulosa, que comprende tratar la biomasa con una cantidad eficaz de una variante de beta-glucosidasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y recuperar la biomasa degradada.
14. Método según la reivindicación 13, que comprende además tratar la biomasa con una cantidad eficaz de endo-1,4-beta-glucanasa y exo-1,4-beta-D-glucanasa.
15. Método para degradar o convertir una biomasa con contenido de celulosa y hemicelulosa, que comprende tratar la biomasa con una célula huésped según la reivindicación 11 y recuperar la biomasa degradada.
16. Método según la reivindicación 15, que comprende además tratar la biomasa con una cantidad eficaz de endo-1,4-beta-glucanasa y exo-1,4-beta-D-glucanasa.
17. Planta que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 8.
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