USO DE UN VECTOR DE EXPRESION PARA UNA CELULA ANIMAL.

Un vector de expresión para una célula animal seleccionada del grupo constituido por una célula CHO,

una BHK y una NIH3T3, en el que el vector comprende un promotor seleccionado del grupo constituido por un promotor del virus SV40 y un promotor del CMV, y el complemento de un elemento MAR de ß-globina que está ubicado en el extremo 5''-terminal del promotor

Uso de un vector de expresión para una célula animal.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un vector de expresión para una célula animal, y más particularmente, a un vector de expresión que incluye el elemento de la región de unión a la matriz nuclear (denominado a continuación en el presente documento "elemento MAR") y el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina.

Muchos tipos de sistemas de expresión, tales como microorganismos, plantas, levaduras, células de insectos y células animales están actualmente en uso para el tratamiento médico mediante la expresión de las proteínas deseadas en una gran cantidad. Entre los muchos tipos de sistemas de expresión, los microorganismos son los más fácilmente usados como sistema de expresión, y muchos tipos de sistemas de microorganismos se estudian y se utilizan como sistema de expresión.

Sin embargo, el uso del sistema de expresión de microorganismos está limitado en algún sentido. En primer lugar, aunque los genes se expresan en un microorganismo, la estructura y caracteres de la proteína expresada son distintos de los de la proteína animal, porque el microorganismo tiene un mecanismo diferente para expresar proteínas y un mecanismo de modificación de proteína tal como glicosilación, fosforilación y amidación. Por tanto, una proteína recombinante producida a partir de microorganismos casi no tiene modificación, o está limitada en la producción de proteínas de las que la función no se ve muy afectada por la diferencia de la modificación y la estructura de las proteínas. Además, cuando se usan las proteínas recombinantes que se expresan por microorganismos, se necesita un proceso de limpieza por la contaminación del microorganismo o toxina.

Aunque las células animales son adecuadas para una expresión de proteínas en animales, el sistema de expresión que usa células animales no se usa comúnmente, porque el sistema de expresión que usa células animales crea costes de producción superiores debido a una eficacia de expresión inferior de la proteína recombinante en comparación con la de microorganismos y células animales.

Una célula animal para la industria, que se usa actualmente para un sistema de expresión incluye CHO (ovario de hámster chino), BHK (riñón de cría de hámster) y mieloma, y se introduce el vector de expresión en la célula animal y se produce una proteína foránea deseada, como en microorganismos.

Por tanto, los sistemas de expresión génica se modifican mediante diversos procedimientos, porque en general se expresa una pequeña cantidad de los genes foráneos. Por ejemplo, se cultiva una cepa de células de CHO en medio que contiene metotrexato (denominado a continuación en el presente documento "MTX") que es un inhibidor de la DHFR (dihidrofolato reductasa), con el fin de obtener la cepa CHO que está viva dependiendo de la concentración de MTX, y expresa altamente la proteína debido al aumento en el número de copias de genes.

Generalmente, cuando se expresan los genes foráneos en una célula animal, el gen foráneo se cotransfecta con el vector que tiene un marcador selectivo y se seleccionan células transformadas a través del cultivo en el medio selectivo durante muchas horas. Sin embargo, la frecuencia para lograr un clon de células que expresan altamente es baja. La baja frecuencia de la expresión del gen foráneo se debe a la inserción cromosómica del gen foráneo en un sistema animal, a diferencia de un microorganismo. Además, aunque el proceso de inserción del gen foráneo sea satisfactorio, no puede esperarse la expresión de los genes foráneos, puesto que el sitio insertado de cada gen difiere y la expresión del gen depende del sitio insertado (Grindley et al., 1987. Trends Genet. 3, 16-22; Kucherlapati et al., 1984. Crit. Rev. Biochem. 16, 349-381; Palmiter et al., 1986. Annu. Rev. Genet. 20, 465-499). Por tanto, aunque los genes foráneos están integrados de manera estable, pueden expresarse en una pequeña cantidad, porque la mayor parte de la expresión génica en células animales está inhibida por el ácido nucleico adyacente (Eissenberg et al., 1991. Trends Genet. 7, 335-340; Palmiter et al., 1986. Annu Rev. Genet. 20, 465-499).

Con el fin de proteger la expresión del gen foráneo de los efectos de posición, se ha informado de la posibilidad de usar elementos de matriz nuclear en varios sistemas. El elemento nuclear a modo de ejemplo incluye un elemento aislante, una región de unión a la matriz nuclear (denominada a continuación en el presente documento "MAR") y una región de unión al armazón proteínico (denominada a continuación en el presente documento "SAR").

Kalos (Kalos et al., 1995 Mol. Cell. Biol. 15, 198-207) sugirió que cuando la MAR de apolipoproteína B estaba combinada con el constructo transgénico del promotor mínimo, el gen foráneo se introducía de manera estable en el cromosoma huésped, de modo que la cantidad expresada del transcrito aumentaba en aproximadamente 200 veces. De manera similar al procedimiento mencionado anteriormente, se informó de que la MAR de lisozima A de pollo y la SAR de ß-interferón pueden aumentar el nivel de expresión del gen foráneo en una célula de vertebrado independientemente del sitio de inserción cromosómica (Eissenberg et al., 1991. Trends Genet. 7, 335-340; Klehr et al, 1991. Biochemistry 30, 1264-1270). Sin embargo, no se ha verificado que la MAR y la SAR puedan aumentar la producción de proteínas en una cepa de células CHO, o que la MAR y la SAR sean adecuadas para su uso común.

Cuando se expresa un gen de célula animal; la síntesis de ARNmr se produce a partir del promotor y finaliza en el sitio de terminación. Los niveles de las proteínas expresadas están influenciados con frecuencia por la eficacia de la terminación de la transcripción así como la estabilidad del ARNm sintetizado.

El sitio de terminación transcripcional que se incluye en un vector de expresión controla la poliadenilación y tiene una influencia en la estabilidad del ARNm. El sitio de terminación incluye una señal de poli-A, un sitio de rotura, un sitio de terminación, y la señal de poliadenilación es AATAAA y está bien estudiada. Sin embargo, no se conocen bien el sitio de rotura en el que se produce la poliadenilación, ni el sitio de terminación en el que se completa la transcripción génica por la enzima II de polimerización de ARN. Además, aunque se informa de que la región rica en GU/U excepto los tres tipos de región crítica controla la poliadenilación del ARNm, no se conoce el mecanismo detallado.

Los vectores de expresión que se usan comúnmente en células animales contienen una señal de poli-A del virus SV40 y BGH (hormona de crecimiento bovina), y no se ha sugerido que el terminador específico, que mejora la estabilidad de ARNm y el nivel de expresión, se desarrolla con el fin de usar el vector de expresión de células animales.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un vector de expresión que tenga un aumento de la eficacia de la expresión y los niveles para genes foráneos en la expresión de proteínas foráneas usadas en un sistema de célula animal.

Con el fin de lograr estos objetivos, la descripción presente proporciona un vector de expresión que comprende el elemento MAR (región de unión a la matriz nuclear) o su secuencia complementaria en el extremo 5'-terminal de un promotor.

Además, la descripción presente proporciona un vector de expresión para células animales que comprende un constructo constituido por la señal de poli-A (poliadenilación) del virus SV 40 y el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina, en el que el constructo tiene una secuencia de SEC ID NO. 3.

Además, la descripción presente proporciona un vector pMSG KCCM 10202 de la SEC ID NO. 8, que comprende una secuencia complementaria de la MAR (región de unión a la matriz nuclear) en 5' de ß-globina humana, y el constructo constituido por la señal de poli-A del virus SV 40 y el sitio de terminación de la transcripción del gen de la gastrina.

Además, la descripción presente un procedimiento de preparación de materiales bioactivos usando un vector de expresión para células animales que comprende un elemento MAR de ß-globina, o la secuencia complementaria de la MAR de ß-globina en el extremo 5'-terminal...

1. Un vector de expresión para una célula animal seleccionada del grupo constituido por una célula CHO, una BHK y una NIH3T3, en el que el vector comprende un promotor seleccionado del grupo constituido por un promotor del virus SV40 y un promotor del CMV, y el complemento de un elemento MAR de ß-globina que está ubicado en el extremo 5'-terminal del promotor.

2. El vector de expresión según la reivindicación 1, en el que el vector de expresión es pMS de la SEC ID NO.1.

3. El vector de expresión según la reivindicación 1, que comprende el promotor del CMV y el complemento del elemento MAR de ß-globina ubicado en el extremo 5'-terminal del promotor.

4. El vector de expresión según la reivindicación 1, que comprende además la secuencia de SEC ID NO. 3 como terminador.

5. El vector de expresión según la reivindicación 4, en el que el vector de expresión es el vector pMSG de la SEC ID NO. 8.

6. Un procedimiento de preparación de materiales bioactivos en una célula animal seleccionada del grupo constituido por una célula CHO, una BHK y una NIH3T3, usando el vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el material bioactivo es TGF-ß SRII.

8. Un procedimiento para aumentar una expresión génica en una célula animal seleccionada del grupo constituido por una célula CHO, una BHK, una NIH3T3, usando el vector de expresión según la reivindicación 1.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el vector de expresión es pMS de la SEC ID NO. 1.

10. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el vector de expresión comprende el promotor del CMV y el complemento del elemento MAR de ß-globina ubicado en el extremo 5'-terminal del promotor.

11. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el vector de expresión comprende además la secuencia de SEC ID NO. 3 como terminador.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que el vector de expresión es el vector pMSG de la SEC ID NO. 8.