El uso de un nuevo aislado de Neospora caninum (depositado en la Culture Collection of Algae and Protozoa,

con número de acceso CCAP 2051/1), y de los extractos obtenidos a partir del mismo, en la elaboración de pruebas de diagnóstico y en la fabricación de productos para el tratamiento y la prevención de la infección causada por Neospora se basa en la facilidad con que el nuevo aislado se transforma del estadio de taquizoíto al de bradizoíto en condiciones in-vitro. Así mismo y con las mismas aplicaciones, se emplean los polipéptidos y polinucleótidos obtenidos a partir del: nuevo aislado y los anticuerpos inmunoreactivos desarrollados frente a antígenos del mismo

Uso de un nuevo aislado de Neospora caninum para el desarrollo de pruebas de diagnóstico y para la fabricación de productos para el tratamiento y prevención de la infección causada por Neospora.

Campo de la técnica. Objeto de la invención

La presente invención se encuadra en el campo de la sanidad animal y se refiere, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, al desarrollo de pruebas de diagnóstico para la detección de Neospora caninum en animales y a la fabricación de composiciones farmacéuticas para la prevención y el tratamiento de la neosporosis en los mismos.

De forma más concreta, la invención se refiere al uso del aislado Nc-Spain 7 de N. caninum que presenta como característica relevante la facilidad de conversión entre los estadios de taquizoíto y bradizoíto en condiciones in vitro, y por ello es un candidato apropiado para la fabricación de nuevos productos vacunales y terapéuticos frente a la neosporosis, y para el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico para detectar la infección causada por el parásito Neospora caninum en animales a partir de muestras biológicas.

Estado anterior de la técnica

Neospora caninum es un parásito perteneciente al phylum Apicomplexa dentro del cual se agrupan los géneros Plasmodium, Babesia, Cryptosporidium, Eimeria y Toxoplasma, que incluyen algunos de los organismos causantes de enfermedad más importantes conocidos por el hombre. N. caninum fue descrito por primera vez en 1984 como un protozoo capaz de producir encefalitis y miositis en perros y, poco después, fue reconocido como un agente productor de aborto y mortalidad neonatal en el ganado bovino. Durante los últimos años, también se han descrito infecciones producidas por el parásito en otros hospedadores que incluyen varios ungulados y cánidos, sin embargo destaca la importancia de la neosporosis en el ganado bovino y en el perro, que actúa como hospedador definitivo en el ciclo biológico, (Dubey et al., 2006, J. Comp. Path. 134: 267-289).

Hasta la fecha se han descrito tres estadios en el ciclo biológico de N. caninum. Los esporozoítos, que se desarrollan en los ooquistes eliminados en las heces del hospedador definitivo y son capaces de infectar al hospedador intermediario. Los taquizoítos, la forma de multiplicación rápida, responsables de la fase aguda de la infección y su propagación a otros tejidos. Y los bradizoítos, el estadio de multiplicación lenta del parásito dando lugar a quistes tisulares donde el parásito permanece acantonado durante la fase crónica de la infección hasta su reactivación.

La neosporosis bovina está considerada como una enfermedad parasitaria de distribución cosmopolita y una de las causas más frecuentes de fallo reproductivo en el ganado bovino en los diversos países productores donde se ha estudiado, incluida España (Pereira-Bueno et al., 2003, Vet Parasitol 111: 143-152). La manifestación clínica más importante de la infección es el aborto que tiene lugar generalmente entre el quinto y séptimo mes de gestación. Además, pueden nacer terneros infectados vivos que pueden presentar problemas neuro-musculares hasta los dos meses postparto. Sin embargo, lo más frecuente es el nacimiento de terneros clínicamente sanos, pero crónicamente infectados. En relación con la transmisión de la enfermedad, la vía fundamental es la infección transplacentaria endógena, aunque se ha demostrado la implicación de la transmisión horizontal (Trees & Willians, 2005, Trends Parasitol. 21(12): 558-561, Dubey et al., 2006, J. Comp. Path. 134: 267-289).

Los métodos de diagnóstico utilizados para detectar la infección por N. caninum, generalmente en bovinos adultos, están constituidos principalmente por técnicas basadas en la detección de anticuerpos séricos específicos frente al parásito. Para ello, se han diseñado diferentes inmunoensayos que engloban la inmunofluorescencia indirecta (IFI), varios ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) e inmunoblot (IB) (Ortega-Mora et al., 2006, Acta Parasitologica 51: 1-14). Los antígenos utilizados en estas pruebas serológicas proceden de taquizoítos obtenidos en cultivos celulares de aislados bovinos y caninos de N. caninum. Taquizoítos enteros, extractos celulares obtenidos a partir de los mismos, proteínas antigénicas purificadas por afinidad a partir de estos extractos celulares o proteínas recombinantes, como se describe en la solicitud de patente WO97/39009, han sido utilizados como antígenos en el desarrollo de estas técnicas. Sin embargo, debemos puntualizar que, aunque un resultado serológico positivo ayuda a identificar un animal adulto infectado, un resultado negativo no descarta definitivamente la infección. Diferentes estudios han demostrado que los anticuerpos séricos frente a N. caninum pueden fluctuar en función de la edad y el estado de gestación, y seroconvertir a títulos que normalmente son considerados negativos (Pereira-Bueno et al., 2000, in: Hemphill A & Gottstein B (Eds), Int J Parasitol 30: 906-909; Quintanilla-Gozalo et al., 2000, in: Hemphill A, Gottstein B (Eds), Int J Parasitol 30: 900-906; Maley et al., 2001, Vet Parasitol. 5; 96 (1): 1-9). Los niveles bajos de anticuerpos frente a N. caninum se han asociado principalmente a infecciones crónicas, donde existe un predominio del estadio de bradizoíto. Así, se ha sugerido que una prueba serológica utilizando antígenos derivados de bradizoítos podría ser más adecuada para la identificación de animales persistentemente infectados (Maley et al., 2001, Vet Parasitol. 5; 96(1):1-9).

Por otra parte, los estudios llevados a cabo para el desarrollo de vacunas para la protección frente a la neosporosis han incluido la evaluación de vacunas inactivadas, vacunas atenuadas, vacunas desarrolladas a partir de proteínas antigénicas recombinantes y vacunas de ADN con resultados variables. Uno de los pocos estudios realizados con bovinos demostró que la vacuna desarrollada a partir de taquizoítos muertos emulsionados con el adyuvante POLYGEN^TM, descrita en la solicitud de patente WO99/20303, era capaz de originar una ligera respuesta inmune celular (Andrianarivo et al., 1999, Int. J. Parasitol. 29, 1613-1625), aunque en reproductoras gestantes fue incapaz de proteger frente a la infección fetal (Andrianarivo et al., 2000, Int J Parasitol. 30(9): 985-90). Actualmente, es la única vacuna frente a N. caninum comercializada y registrada en los Estados Unidos denominada NeoGuard^TM cuya eficacia ha sido recientemente evaluada en el campo (Romero et al., 2004, Vet Parasitol. 123(3-4): 149-59).

Debemos destacar que todas las vacunas vivas atenuadas, como se describe en las patentes EP0841392 y WO2004/ 026903, e inactivadas, como las descritas en las patentes EP0898969 y WO99/20303, han sido elaboradas a partir de taquizoítos mantenidos en cultivo celular o a partir de proteínas antigénicas recombinantes que son expresadas en este estadio del ciclo biológico, como se recoge en la solicitud de patente EP0953641, y no a partir del estadio de bradizoíto, predominante en las infecciones crónicas.

Actualmente, en N. caninum no se conocen en detalle los procesos implicados en la conversión taquizoíto-bradizoíto. Durante los últimos años, en un único estudio se ha procedido a su obtención a partir de quistes tisulares purificados de animales infectados experimentalmente (McGuire et al., 1997, J. Parasitol. 83: 647-651), aunque el elevado número de bradizoítos necesarios para los diferentes estudios ha planteado el desarrollo de nuevos métodos para su obtención in vitro. Estos métodos se han basado principalmente en la utilización de compuestos químicos como el nitroprusiato sódico como agente inductor de la transformación en diferentes líneas celulares (Vonlaufen et al., 2002, Int. J. Parasitol. 32: 1253-1265; Risco-Castillo et al., 2004, J. Parasitol. 90(3): 466-70). Y cabe resaltar que en los estudios realizados con diferentes aislados (Nc-Liverpool, Nc-1, Nc-2 y Nc-SweB1) también se observaron diferencias significativas en el porcentaje de transformación entre ambos estadios en función del aislado utilizado (Weiss et al., 1999, Int. J. Parasitol. 29: 1713-1723; Vonlaufen, 2002, Int. J. Parasitol. 32: 1253-1265). Estas diferencias podrían ser atribuibles a la diversidad biológica que existe entre diferentes aislados de N. caninum.

Los estudios comparativos de las propiedades biológicas de distintos aislados de N. caninum...

1. Parásito aislado a partir de tejido nervioso bovino, de la especie Neospora caninum y denominado Nc-Spain7, depositado en la Colección de Cultivos de Algas y Protozoos con número de acceso CCAP 2051/1.

2. Cultivo celular biológicamente puro infectado por el aislado Nc-Spain7.

3. Cultivo celular biológicamente puro infectado por el aislado Nc-Spain7, según la reivindicación 2, caracterizado porque es un cultivo de células de riñón de mono verde.

4. Uso de los cultivos celulares de las reivindicaciones 2 y 3 para la obtención de taquizoítos de Nc-Spain7.

5. Uso de los cultivos celulares de las reivindicaciones 2 y 3 para la obtención de bradizoítos de Nc-Spain7.

6. Uso de los cultivos celulares de las reivindicaciones 2 y 3 para la obtención de ADN genómico de taquizoítos de Nc-Spain7.

7. Uso de taquizoítos de Nc-Spain7 para producir anticuerpos frente a Neospora caninum.

8. Uso del aislado Nc-Spain7 de la reivindicación 1 en la elaboración de una vacuna para el tratamiento y/o prevención de la infección causada por Neospora en animales.

9. Uso del aislado Nc-Spain7, según la reivindicación 8, caracterizado porque la elaboración de la vacuna se realiza a partir del aislado Nc-Spain7 vivo atenuado, inactivado y/o fijado en cualquiera de los estadios del ciclo biológico.

10. Uso del aislado Nc-Spain7, según la reivindicación 8, caracterizado porque la elaboración de la vacuna se realiza a partir de un extracto y/o lisado celular del aislado Nc-Spain7 en cualquiera de los estadios del ciclo biológico.

11. Uso del aislado Nc-Spain7, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque la vacuna se prepara como inyectable en formulaciones líquidas o en forma sólida para su posterior reconstitución.

12. Uso del aislado Nc-Spain7, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque la vacuna se prepara como formulación oral.

13. Uso del aislado Nc-Spain7, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, que comprende un adyuvante y/o una o varias citoquinas y/o inmunoestimuladores.

14. Composición vacunal que comprende taquizoítos purificados de Nc-Spain7 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

15. Composición vacunal, según la reivindicación 14, en la que los taquizoítos están inactivados.

16. Composición vacunal, según cualquiera de las reivindicaciones 14 y 15, en la que se incluye un adyuvante.

17. Uso del aislado de Neospora caninum de la reivindicación 1 en el diagnóstico de la infección causada por Neospora.

18. Uso según la reivindicación 17 en el que el diagnóstico se realiza mediante técnicas inmunológicas.

19. Uso según la reivindicación 18 en el que las técnicas inmunológicas se basan en el empleo de proteínas antigénicas de Nc-Spain7.

20. Uso según la reivindicación 19 en el que las proteínas antigénicas se caracterizan por tener una masa molecular aparente de 17, 24, 28, 30, 34-35, 37, 39 ó 72-74 kDa.

21. Uso según la reivindicación 17 en el que las técnicas inmunológicas se basan en el empleo de los extractos completos del aislado Nc-Spain7.

22. Uso según la reivindicación 17 en el que las técnicas inmunológicas se basan en el empleo de anticuerpos frente al aislado Nc-Spain7.

23. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 19-22 en el que la técnica inmunológica empleada es el inmunoblot.

24. Uso de las secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y/o 12 del aislado de la reivindicación 1 en el diagnóstico de la neosporosis mediante técnicas de detección de ácidos nucleicos.

25. Uso según la reivindicación 24 en el que la técnica de detección de ácidos nucleicos utilizada es la PCR.

26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 y 25 en el que la técnica de detección de ácidos nucleicos se aplica al DNA del parásito extraído a partir de una muestra biológica.