UNION A GMP CICLICA, MATERIALES DE FOSFODIESTERASA ESPECIFICOS A GMP CICLICOS Y METODOS.

Un polinucleótido purificado y aislado que codifica un fragmento de polipéptido de la cGB-PDE humana que consiste en los aminoácidos 516-875 de la SEC. ID. Nº: 23

Unión a GMP cíclica, materiales de fosfodiesterasa específicos a GMP cíclicos y métodos.

El trabajo experimental descrito en el presente documento ha sido realizado en parte con los subsidios a la investigación GM15731, DK21723, DK40029 y GM41269 y el Medical Scientist Training Program Grant GM07347 concedido por los Institutos Nacionales de la Salud norteamericanos. El gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.

La presente invención se refiere de forma general a una fosfodiesterasa específica de guanosín monofosfato cíclico que se une al guanosín monofosfato cíclico, designada como cGB-PDE.

Las fosfodiesterasas (PDEs) de nucleótidos cíclicos que catalizan la hidrólisis de 3'5'-nucleótidos cíclicos tales como el guanosín monofosfato cíclico (GMPc) y el adenosín monofosfato cíclico (AMPc) en los correspondientes nucleótidos 5'-monofosfatos constituyen una familia compleja de enzimas. Al mediar la concentración intracelular de los nucleótidos cíclicos, las isoenzimas de la PDE actúan en rutas de transducción de señales en las que participan segundos mensajeros de nucleótidos cíclicos.

Se han aislado numerosas PDEs de diferentes fuentes tisulares y muchas de las PDEs actualmente caracterizadas presentan diferencias en cuanto a propiedades biológicas, incluidas las propiedades físico-químicas, especificidad de sustrato, sensibilidad a los inhibidores, reactividad inmunológica y modo de regulación [ver Beavo y col., Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, John Wiley & Sons, Chichester, R.U. (1990)]. La comparación de secuencias de aminoácidos conocidas de diferentes PDEs muestra que la mayoría de las PDEs son proteínas multidominio quiméricas que tienen diferentes dominios catalíticos y reguladores [ver Charbonneau, pág. 267-296 en Beavo y col., supra]. Todas las PDEs de mamífero actualmente caracterizadas comparten una secuencia de aproximadamente 250 residuos de aminoácido de longitud que parece comprender el sitio catalítico y está situada en la región terminal carboxilo de la enzima. Los dominios PDE que interactúan con moléculas alostéricas o reguladoras se piensa que están situados dentro de las regiones amino-terminales de las isoenzimas. De acuerdo con sus propiedades biológicas, las PDEs pueden clasificarse de forma general en seis familias: las PDEs estimuladas por Ca²⁺/calmodulina (Tipo I), las PDEs estimuladas por GMPc (Tipo II), las PDEs inhibidas por GMPc (Tipo III), las PDEs específicas de AMPc (Tipo IV), las PDEs específicas de GMPc o cGB-PDE (Tipo V), que constituye el objeto de la presente invención, y las PDE fotorreceptoras específicas de GMPc (Tipo VI).

Las PDEs que se unen a GMPc (PDEs de Tipo II, Tipo V y Tipo VI), además de tener un dominio catalítico homólogo cerca de su extremo terminal carboxilo, tienen una segunda secuencia conservada que está situada más cerca de su extremo terminal amino y que puede comprender un dominio de unión a GMPc alostérico (ver Charbonneau y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 288-292 (1990)).

Las PDEs estimuladas por GMPc (cGs-PDEs) de tipo II están ampliamente distribuidas por diferentes tipos de tejidos y se cree que existen como homodímeros de subunidades de 100-105 kDa. Las cGs-PDEs responden en condiciones fisiológicas a concentraciones elevadas de GMPc aumentando la velocidad de la hidrólisis de AMPc. La secuencia de aminoácidos de una cGs-PDE de corazón bovino y una secuencia parcial de ADNc de una cGS-PDE de corteza suprarrenal bovina se describen en LeTrong y col., Biochemistry, 29: 10280-10288 (1990) y secuencias de ADNc de cGB-PDE de longitud completa de corteza suprarrenal bovina y cerebro fetal humano se describen en PCT WO 92/18541, publicada el 29 de octubre de 1992. La secuencia de longitud completa de ADNc de corteza suprarrenal bovina también se describe en Sonnenburg y col., J. Biol Chem., 266: 17655-17661 (1991).

Las PDEs fotorreceptoras y las cGB-PDE se han descrito como PDEs específicas de GMPc porque presentan una selectividad para hidrolizar el GMPc como mínimo 50 veces mayor que la que presentan para el AMPc.

Las PDEs fotorreceptoras son la PDE del segmento externo del bastón (ROS-PDE) y la PDE del cono (COS-PDE). La estructura de la holoenzima de la ROS-PDE consiste en dos grandes subunidades a (88 kDa) y ß (84 kDa), ambas catalíticamente activas, y dos subunidades reguladoras y más pequeñas (ambas de 11 kDa). También se ha identificado una forma soluble de la ROS-PDE que incluye las subunidades a, ß y ? y una subunidad d (15 kDa) que parece ser idéntica a la subunidad de 15 kDa de COS-PDE. Un ADNc de longitud completa que corresponde a la subunidad a de ROS-PDE de membrana bovina se describe en Ovchinnikov y col., FEBS Lett., 223: 169-173 (1987) y un ADNc de longitud completa que corresponde a la subunidad ß de ROS-PDE bovino se describe en Lipkin y col., J. Biol. Chem., 265: 12955-12959 (1990). Ovchinnikov y col., FEBS Lett., 204: 169-173 (1986) describen un ADNc de longitud completa que corresponde a la subunidad y de ROS-PDE bovino y la secuencia de aminoácidos de la subunidad d. También se ha descrito la expresión de la ROS-PDE en cerebro en Collins y col., Genomics, 13: 698-704 (1992). La COS-PDE está compuesta de dos subunidades a' (94 kDa) idénticas y tres subunidades más pequeñas de 11 kDa, 13 kDa y 15 kDa. Un ADNc de longitud completa que corresponde a la subunidad a' de COS-PDE bovino se presenta en Li y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 293-297 (1990).

La cGB-PDE ha sido purificada hasta la homogeneidad en rata [Francis y col., Methods Enzymol. 159: 722-729 (1988)] y tejido de pulmón bovino [Thomas y col., J. Biol. Chem., 265: 14964-14970 (1990), en adelante "Thomas I"]. La presencia de estas enzimas o de otras similares se ha descrito en numerosos tejidos y especies, incluida la rata y plaquetas humanas [Hamet y col. Adv. Cyclic Nucleotide Protein Phosphorylation Res., 16: 119-136 (1984)], bazo de rata [Coquil y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 127: 226-231 (1985)], pulmón de cobaya [Davis y col., J. Biol. Chem., 252: 4078-4084 (1977)], músculo liso vascular [Coquil y col., Biochim. Biophys. Acta, 631: 148-165 (1980)] y esperma de erizo de mar [Francis y col., J. Biol Chem., 255: 620-626 (1979). La cGB-PDE puede ser un homodímero que comprende dos subunidades de 93 kDa [ver Thomas I, supra]. La cGB-PDE ha demostrado contener un único sitio que no se halla en otras PDEs que se unen a GMPc conocidas que es fosforilado por la proteína quinasa dependiente de GMPc (cGK) y, con menor afinidad, por la proteína quinasa dependiente de AMPc(cAK) [ver Thomas y col., J. Biol Chem., 265: 1497114978 (1990), en adelante "Thomas II"]. La principal secuencia de aminoácidos del sitio de fosforilación y del extremo amino-terminal de un fragmento generado por digestión quimiotríptica de la cGB-PDE se describe en Thomas II, supra, y en Thomas 1, supra, respectivamente. Sin embargo, la mayor parte de la secuencia de aminoácidos de cGB-PDE no ha sido anteriormente descrita.

Se encuentran descritos en la bibliografía diferentes inhibidores de diferentes tipos de PDEs. Dos inhibidores que presentan cierta especificidad por las PDEs de tipo V son el zaprinast y el dipiridamol (ver Francis y col., págs. 117-140 en Beavo y col., supra).

El estudio del ADN y de las secuencias de aminoácidos que codifican la cGB-PDE y la producción de polipéptido cGB-PDE mediante métodos recombinantes proporcionaría información y material que permitirían la identificación de nuevos agentes que modulasen de forma selectiva la actividad de las cGB-PDEs. El reconocimiento de que existen diferentes tipos o familias de isoenzimas de la PDE y que diferentes tejidos expresan diferentes complementos de PDEs ha suscitado interés en el desarrollo de moduladores de PDE que pueden tener indicaciones terapéuticas para patologías en las que intervienen rutas de transducción de señales que utilizan nucleótidos cíclicos como segundos mensajeros. Diferentes inhibidores selectivos y no selectivos de la actividad PDE se discuten en Murray y col., Biochem. Soc. Trans., 20(2): 460-464 (1992). El desarrollo de moduladores de PDE sin poder producir una PDE específica mediante técnicas de ADN recombinante resulta difícil porque todas las PDEs catalizan la misma reacción básica, presentan especificidades de sustrato superpuestas y se producen sólo en cantidades traza. Como resultado, la purificación hasta la homogeneidad de muchas PDEs es un proceso tedioso y difícil.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de disponer de información sobre...

1. Un polinucleótido purificado y aislado que codifica un fragmento de polipéptido de la cGB-PDE humana que consiste en los aminoácidos 516-875 de la SEC. ID. Nº: 23.

2. Un polinucleótido purificado y aislado que codifica un fragmento de polipéptido de la cGB-PDE humana que consiste en los aminoácidos 515-819 de la SEC. ID. Nº: 23.