UN METODO PARA PRODUCIR POLIPEPTIDO GLP-1 (7-36) INSULINOTROPICO Y/O ANALOGOS DE GPL-1.

Un método para producir polipéptido GLP-1 (7-36) insulinotrópico y/o análogos de GLP-1 que consiste en:

(a) Introducir dos puntos con división de endonucleasas individuales restrictivas capaces de formar un punto híbrido en las dos terminales del gen que pueden codificar el polipéptido GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1;

(b) Ligar los extremos cohesivos para formar un punto híbrido tras la digestión con las endonucleasas restrictivas, y clonar en un vector N copias del gen GLP-1 (7-36) unido a la serie, gen de análogos de GLP-1, o genes unidos de manera interactiva que codifican el polipéptido GLP-1 (7-36) o análogos de GLP-1, donde N es un número entero entre 2 y 32;

(c) Transformar el vector que contiene el gen unido a la serie en una célula huésped.

(d) Expresar en la célula huésped una proteína de fusión que contiene N copias de un polipéptido donde N es un número entero entre 2 y 32, conteniendo dicha proteína de fusión el polipéptido GLP-1 (7-36), análogos de GLP-1 o la combinación de los mismos, pero sin ninguna proteína portadora;

(e) Partir la proteína de fusión;

(f) Separar y purificar los polipéptidos GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1

Un método para producir polipéptido GLP-1 (7-36) insulinotrópico y/o análogos de GLP-1.

Campo de la invención

La invención describe un método para producir péptido GLP-1 (7-36) polipéptido similar al glucagón o análogos de péptido-1 similar a glucagón ligando genes de una manera conjunta. La administración exógena de GLP-1 (7-36) o análogos de GLP-1 puede estimular la secreción de insulina.

Contexto de la invención

GLP-1 (péptido-1 similar a glucagón) es una hormona peptídica segregada por células intestinales humanas, que se desarrolla a partir de la división proteolítica de proglucagón por una proteasa producida por célula L, y es por lo tanto llamada péptido-1 similar al glucagón. Múltiples estudios han demostrado que la administración exógena de GLP-1 aumenta los efectos de secreción de insulina. Por ejemplo, cuando la glucosa en sangre supera 6 mmol/L, una concentración muy baja de GLP-1 puede jugar un significativo papel en el aumento de secreción de insulina. Una vez que se restablece la glucosa en sangre en un nivel normal, la posterior adición de GLP-1 no tiene más efectos en la secreción de insulina.

GLP-1 está presente en dos formas en el cuerpo humano, una es GLP-1 (7-36)-NH₂ que consiste en 30 residuos de aminoácidos con su terminal C convertida en amida. La otra es GLP-1 (7-37) que consiste en 31 residuos de aminoácidos. Tanto GLP-1 (7-36)-NH₂ como GLP-1 (7-37) pueden tener fuertes efectos para el aumento o mejora de secreción de insulina. En lo relativo a los efectos mejorados de GLP-1 (7-36)-NH₂ se ha descubierto que la conversión a amida de la terminal C no se requiere necesariamente, porque el péptido GLP-1 (7-36)-OH (referido de ahora en adelante como GLP-1 (7-36) posee efectos mejorados similares en la secreción de insulina.

Estudios previos han demostrado que GLP-1 tiene más ventajas que la insulina en el tratamiento de diabetes mellitus tipo II ya que GLP-1 puede: 1) aumentar la regulación de la transcripción y traslación de gen de proinsulina; 2) aumentar la secreción de insulina y C-péptido, 3) aumentar la sensibilidad del receptor celular de insulina, 4) aumentar el total de células ß. Además, GLP-1 también puede disminuir: 1) la resistencia a la insulina, 2) la cantidad de glicohemoglobina (HbA1c), fructosamina, glucagón y ácidos grasos (Nielsen J. H. et al., Regulación de masa celular beta por hormonas y factores del crecimiento, Diabetes, 50, supl. 1: S25-9, 2001; Hui H. et al., Péptido 1 similar al glucagón produce diferenciación de células pancreáticas positivas 1 de homeobox duodenal en islote en células segregadoras de insulina, Diabetes, 50(4): 785-96, 2001.

Más notablemente, se observa que GLP-1 es capaz de mejorar la división de célula ß y por lo tanto aumentar el total de células ß, que no se ha encontrado en otras medicinas empleadas para tratamiento de diabetes hasta la fecha. Además, GLP-1 es efectivo en aquellos pacientes que no han respondido al tratamiento con administración de sulfonilurea. Además, la administración de GLP-1 no aumenta la secreción de insulina cuando la concentración de glucosa en sangre se restablece a un nivel normal. Por lo tanto, no da como resultado la hipoglucemia. Por todas las razones mencionadas, se considera que GLP-1 es una medicina deseable para tratar diabetes mellitus. Sustanciales estudios clínicos también han verificado este hecho (Rachman J. et al., Normalización de respuesta de insulina a glucosa mediante infusión nocturna de péptido similar a glucagón 1 (7-36) amida en pacientes con NIDDM, Diabetes, 45(11):1524-30, 1996; Doyle M. E. et al., péptido 1 similar a glucagón, Progreso reciente en Investigación de Hormonas, 56:377-99, 2001; Daniel J. Drucker, Minireview: Los Péptidos similares a glucagón, Endocrinología, 142(2):521-527, 2001).

WO 98/08873 está relacionada con un método para mejorar la recuperación tras operación evitando la reacción catabólica y resistencia a la insulina provocada por el trauma quirúrgico. Los autores de esta publicación proponen el uso de péptido-1 (GLP-1) similar a glucagón o análogo para eliminar los cambios catabólicos tras cirugía.

WO 99/43341 está relacionada con una composición que contiene un derivado de GLP-1 con solubilidad y/o estabilidad mejorada, y/o un método para mejorar la solubilidad y/o estabilidad de un GLP-1 o un fragmento o un análogo del mismo. En particular, se proporcionan los derivados de GLP-1 con un contenido de hélice que excede el 25% que parcialmente forma agregados estructurales del tipo micelar.

WO 99/43705 describe derivados con terminal N de péptido-1 (GLP-1 ) similar a glucagón humano y análogos del mismo que tiene un perfil prolongado de acción, así como el uso de tales derivados en composiciones farmacéuticas para el tratamiento de obesidad, diabetes mellitus dependiente de insulina o no dependiente de insulina. Los derivados de GLP-1 tiene un sustituyente lipofílico unido a, al menos, un residuo de aminoácido.

Sin embargo, el coste de las síntesis química de GLP-1 es bastante alto. El precio al por menor de GLP-1 con calidad de reagente es 400 textdollar/mg, lo que restringe en gran medida su aplicación en clínicas. Algunos investigadores han intentado usar métodos de ingeniería genética para producir GLP-1 recombinante ya sea como proteína de fusión o como proteína segregadora. La producción y el coste de esta técnica para producir GLP-1 siguen siendo aún poco satisfactorios, lo que provoca que la producción a gran escala de GLP-1 a un coste bajo resulte imposible en este momento. Esta invención está dirigida a desarrollar un método nuevo para producir GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1 ligando genes de una manera conjunta. El método de la presente invención puede usarse para simplificar el proceso, para disminuir el coste de producción, y posibilitando de este modo la producción de GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1 a gran escala.

Breve resumen de la invención

Esta invención está relacionada con un método para producir polipéptido insulinotrópico GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1 que consiste en:

        (a)        Introducir dos puntos con división de endonucleasas individuales restrictivas capaces de formar un punto híbrido en las dos terminales del gen que pueden codificar el GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1;

        (b)        Ligar los extremos cohesivos para formar un punto híbrido tras la digestión con las endonucleasas restrictivas, y clonar en un vector N copias del gen GLP-1 (7-36) unido a la serie, gen de análogos de GLP-1. o genes unidos de manera interactiva que codifican el polipéptido GLP-1 (7-36) o análogos de GLP-1, donde N es un número entero entre 2 y 32;

        (c)        Transformar el vector que contiene el gen unido a la serie en una célula huésped.

        (d)        Expresar en la célula huésped una proteína de fusión que contiene N copias de un polipéptido donde N es un número entero entre 2 y 32, conteniendo dicha proteína de fusión el polipéptido GLP-1 (7-36), análogos de GLP-1 o la combinación de los mismos, pero sin ninguna proteína portadora;

        (e)        Partir la proteína de fusión;

        (f)        Separar y purificar los polipéptidos GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1.

Las endonucleasas restrictivas anteriormente mencionadas capaces de formar híbridos pueden incluir, aunque no se limitan a, Bgl II y BamH I, Sal y Xho I.

El vector en el método de acuerdo con la presente invención puede contener genes unidos a N series o genes de GLP-1 (7-36) unidos interactivamente y/o genes análogos de GLP-1, donde N es un número entero entre 2 y 32. Preferiblemente, N es un número entero de 8 a 32. Más preferiblemente, N debería ser 16 o 32.

Las células huéspedes usadas en el método de acuerdo con la presente invención pueden expresar...

1. Un método para producir polipéptido GLP-1 (7-36) insulinotrópico y/o análogos de GLP-1 que consiste en:

(a)        Introducir dos puntos con división de endonucleasas individuales restrictivas capaces de formar un punto híbrido en las dos terminales del gen que pueden codificar el polipéptido GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1;

(b)        Ligar los extremos cohesivos para formar un punto híbrido tras la digestión con las endonucleasas restrictivas, y clonar en un vector N copias del gen GLP-1 (7-36) unido a la serie, gen de análogos de GLP-1, o genes unidos de manera interactiva que codifican el polipéptido GLP-1 (7-36) o análogos de GLP-1, donde N es un número entero entre 2 y 32;

(c)        Transformar el vector que contiene el gen unido a la serie en una célula huésped.

(d)        Expresar en la célula huésped una proteína de fusión que contiene N copias de un polipéptido donde N es un número entero entre 2 y 32, conteniendo dicha proteína de fusión el polipéptido GLP-1 (7-36), análogos de GLP-1 o la combinación de los mismos, pero sin ninguna proteína portadora;

(e)        Partir la proteína de fusión;

(f)        Separar y purificar los polipéptidos GLP-1 (7-36) y/o análogos de GLP-1.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 donde las dos endonucleasas de restricción capaces de formar un híbrido son Bgl II y BamH I.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 donde las dos endonucleasas de restricción capaces de formar un híbrido son Sal I y Xhol I.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 donde dicho vector contiene N copias del gen unido en serie, donde N es un número entero de 2 a 32.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4 donde dicho vector contiene N copias del gen unido en serie, donde N es un número entero de 8 a 32.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5 donde dicho vector contiene N copias del gen unido en serie, donde N es 16.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5 donde dicho vector contiene N copias del gen unido en serie, donde N es 32.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 6 donde dicho vector es el contenido en el depósito de CGMCC con Número de Acceso 0599.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha célula huésped puede expresar una proteína de fusión que contiene N copias de un polipéptido, donde N es un número entero de 2 a 32.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, donde dicha célula huésped puede expresar una proteína de fusión que contiene N copias de un polipéptido, donde N es un número entero de 8 a 32.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicha célula huésped puede expresar una proteína de fusión que contiene N copias de un polipéptido, donde N es 16.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicha célula huésped puede expresar una proteína de fusión que contiene N copias de un polipéptido, donde N es 32.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12 donde dicha célula huésped es una célula procariótica.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13 donde dicha célula huésped es Escherichia coli JM103, JM109, HB101 o DH5a.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14 donde dicha célula huésped es la contenida en depósito de CGMCC con Número de Acceso 0599.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1 donde la proteasa usada para partir la proteína de fusión es Clostrispan o Tripsina.