UN METODO PARA AUMENTAR EL PESO DE SEMILLAS.

Un método para incrementar el peso de semillas, comprendiendo el método modificar genéticamente una célula vegetal para incrementar el contenido de giberelina de la semilla por A) (i) transformar la célula vegetal para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de la biosíntesis de giberelina o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación;

(ii) transformar la célula vegetal para expresar una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de una enzima de inactivación de giberelina o (iii) mutagénesis de la célula vegetal y B) regenerar una planta incluyendo la semilla a partir de la célula vegetal

Un método para aumentar el peso de semillas.

La presente invención se refiere a un método para incrementar el peso de semillas.

Se han desarrollado técnicas de cultivo de plantas desde métodos tradicionales hasta el uso de tecnología de ADN recombinante para introducir deseables características genéticas en plantas, particularmente especies de plantas de cultivo agrícola, de interés.

Los estudios previos en este área han descubierto que el crecimiento vegetal se puede regular por la expresión de enzimas importantes en la biosíntesis de giberelinas (GAs). Las giberelinas son un gran grupo de ácidos carboxílicos diterpenoides que están presentes en todas las plantas superiores y algunos hongos. Ciertos miembros del grupo funcionan como hormonas vegetales y están implicadas en muchos procesos del desarrollo, que incluyen la germinación de la semilla, extensión del tallo, expansión de las hojas, inicio y desarrollo de las flores, y crecimiento de las semillas y frutos. Las GAs biológicamente activas son usualmente compuestos de C₁₉ que contienen una 19-10 lactona, un ácido carboxílico de C-7 y un grupo 3β-hidroxilo. Las últimas etapas de su biosíntesis implican la retirada oxidativa de C-20 y la hidroxilación en C-3. La hidroxilación en la posición 2β da como resultado la producción de productos biológicamente inactivos. Esta reacción es la ruta más importante para el metabolismo de GA en plantas y asegura que las hormonas activas no se acumulan en los tejidos vegetales. Las enzimas biosintéticas de GA 7-oxidasa, 20-oxidasa, 3β-hidroxilasa y 2β-hidroxilasa son todas dioxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato. Estas son un gran grupo de enzimas para las que el 2-oxoglutarato es un co-substrato que se descarboxila a succinato como parte de la reacción (véase la revisión por Hedden, P. and Kamiya, Y., en Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48. 431-460 (1997)).

Los reguladores químicos del crecimiento vegetal se han usado en horticultura y agricultura durante muchos años. Muchos de estos compuestos funcionan cambiando la concentración de GA en los tejidos vegetales. Por ejemplo, los retardantes del crecimiento inhiben la actividad de las enzimas implicadas en la biosíntesis de GA y por ello reducen el contenido de GA. Tales productos químicos se usan comúnmente, por ejemplo, para prevenir el encamado en cereales y para controlar el crecimiento de plantas hortícolas y ornamentales. A la inversa, se pueden aplicar GAs a plantas, tales como en la aplicación de GA₃ a uvas sin semillas para mejorar el tamaño y forma de la uva, y a grano de cebada para mejorar la producción de malta. Las mezclas de GA₄ y GA₇ se aplican a manzanas para mejorar la calidad de la fruta y a ciertas coníferas para estimular la producción de piñas. Hay varios problemas asociados al uso de reguladores de crecimiento. Algunos de los retardantes del crecimiento son muy persistentes en el suelo haciendo difícil cultivar otros cultivos después del cultivo tratado. Otros requieren aplicaciones repetidas para mantener el efecto requerido. Es difícil restringir la aplicación a los órganos objetivo de la planta sin que se extienda a otros órganos o plantas y sin que tengan efectos indeseables. La administración precisa de la aplicación del regulador del crecimiento puede ser una labor muy intensa. Una opción no química para controlar la morfología de la planta es, de este modo, muy deseable.

La biosíntesis de giberelina ha sido modificada en plantas transgénicas. Véase por ejemplo, el documento WO 94/28141 que publica la clonación y expresión de un gen de giberelina (GA) 20-oxidasa que cataliza la penúltima etapa en al biosíntesis de GA, o el documento WO 99/66029 que publica la clonación y expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican una enzima giberelina 2β-hidroxilasa (GA 2-oxidasa) que es una enzima de inactivación de giberelina. Cataliza la 2β-oxidación (2-oxidación) de una molécula de giberelina para introducir un grupo hidroxilo en C-2 y cataliza adicionalmente la oxidación del grupo hidroxilo introducido en C-2 para dar el derivado de cetona.

Se ha introducido ahora un sistema de nomenclatura para los genes de biosíntesis de GA (Coles et al. The Plant Journal 17(5) 547-556 (1999). Las referencias a "giberelina" incluyen todas las moléculas de giberelina bioactiva, a menos que el contexto lo especifique de otro modo.

Ha sido un objetivo desde hace mucho tiempo en agricultura ser capaces de incrementar el tamaño de las semillas producidas por especies vegetales de interés. Para muchas plantas, las semillas son el principal producto a ser cosechado y un incremento de tamaño sería beneficioso para mejorar los rendimientos totales de la cosecha. Para todas las especies de plantas agrícolas, un incremento del tamaño de la semilla puede ayudar al éxito de trasplantar un cultivo proporcionando a la planta en desarrollo un mayor recurso para la germinación de la semilla.

Se ha encontrado ahora sorprendentemente que por la manipulación de la expresión de enzimas giberelina se puede conseguir un incremento del peso de las semillas.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para incrementar el peso de semillas, comprendiendo el método modificar genéticamente una célula vegetal para incrementar el contenido de giberelina de la semilla por A) (i) transformar la célula vegetal para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de biosíntesis de giberelina o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación; (ii) transformar la célula vegetal para expresar una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de una enzima de inactivación de giberelina; o (iii) mutagénesis de la célula vegetal y B) regenerar una planta incluyendo la semilla a partir de la célula vegetal.

Las semillas producidas según un método de la invención tienen un peso incrementado en comparación con las semillas de las plantas de control. Las plantas y sus semillas derivadas de dichas plantas obtenibles directamente por el método de la invención no están incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Las semillas son los óvulos vegetales maduros que contienen un embrión de una planta gimnosperma o angiosperma.

Las especies de plantas preferidas incluyen pero no están limitadas a plantas monocotiledóneas que incluyen semillas y su progenie o propágulos, por ejemplo, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Triticale, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale y Setaria. Las plantas transgénicas especialmente útiles son plantas de maíz, trigo, cebada y sus semillas. Apropiadamente, las monocotiledóneas se seleccionan del grupo que consiste en trigo, maíz, centeno, arroz, avena, cebada, sorgo y mijo.

Las plantas dicotiledóneas para su transformación según la presente invención y las plantas transgénicas preferidas incluyen pero no están limitadas a las especies Fabaceae, Solatium, Brassicaceae, especialmente patatas, alubias, repollo, árboles forestales, rosas, clemátide, canola, girasol, crisantemo, flor de pascua y boca de dragón. Alternativamente, la planta transgénica puede ser una planta dicotiledónea. Apropiadamente, la dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste en soja, canola y girasol.

Las plantas usadas en los métodos de la invención están modificadas para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de biosíntesis de giberelina, o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación, o para expresar moléculas de ácido nucleico para inhibir la expresión de enzimas de inactivación de giberelina, o para manipular de otro modo el contenido de giberelina en la semilla, tal como por ejemplo por mutagénesis, convenientemente por mutagénesis química. La expresión de una secuencia de ácido nucleico incluye la sobreexpresión por encima de los niveles basales o endógenos, que se puede definir con respecto a los niveles de expresión en una planta sin alterar o de control de la misma especie. La expresión de tales secuencias de ácido nucleico por lo tanto incluye la expresión de un gen exógeno introducido dentro de la planta, así como la introducción de secuencias de promotor para dirigir la expresión del gen endógeno, tal como, por ejemplo, recombinación homóloga.

La secuencia de ácido nucleico puede ser como se muestra en una cualquiera de las Figuras 4, 6, 8 o 10, o su cadena...

1. Un método para incrementar el peso de semillas, comprendiendo el método modificar genéticamente una célula vegetal para incrementar el contenido de giberelina de la semilla por

2. Un método según la reivindicación 1, en el que la planta es monocotiledónea.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que la planta monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste en trigo, maíz, centeno, arroz, avena, cebada, sorgo y mijo.

4. Un método según la reivindicación 1, en el que la planta es dicotiledónea.

5. Un método según la reivindicación 4, en el que la planta dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste en soja, canola, y girasol.

6. Un método según la reivindicación 1, en el que el contenido de giberelina se ha incrementado por expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima del metabolismo de giberelina que comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en la Figura 4 o la Figura 6, o su cadena complementaria o una secuencia homóloga a ella.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que la enzima del metabolismo de giberelina es giberelina 20-oxidasa (GA20ox) o giberelina 3β-hidroxilasa (GA 3-oxidasa).

8. Un método según la reivindicación 1, en el que se ha incrementado el contenido de giberelina por expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación que comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en la Figura 8.

9. Un método según la reivindicación 8, en el que la enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación es giberelina 1,2-desaturasa (GAdes).

10. Un método según la reivindicación 1, en el que se ha incrementado el contenido de giberelina por expresión de una molécula de ácido nucleico para inhibir la expresión de enzimas de inactivación de giberelina que comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en la Figura 10.

11. Un método según la reivindicación 10, en el que la enzima de inactivación de giberelina es la enzima giberelina 2β-hidroxilasa (GA 2-oxidasa).

12. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que el incremento del peso de la semilla es por lo menos del 5%.

13. Un método según la reivindicación 12, en el que el incremento del peso de la semilla está en el intervalo de 5% a 40%.

14. El uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de biosíntesis de giberelina para la preparación de semillas con un peso incrementado.

15. El uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación en la preparación de semillas con un peso incrementado.

16. El uso de una secuencia de ácido nucleico que inhibe la expresión de enzimas de inactivación de giberelina en la preparación de semillas con un peso incrementado.

17. Un método para incrementar la resistencia a la sequía de una semilla, que comprende preparar una planta genéticamente modificada en la que se ha incrementado el contenido de giberelina en la semilla de la planta, incrementando por ello el peso de la semilla.