Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de:

(a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, o en la SEQ ID NO: 3, o un complemento de la misma; y

(b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, o en la SEQ ID NO: 4, o un complemento de la misma

Fad4, Fad5, Fad5-2 y Fad6, miembros de la familia de desaturasas de ácidos grasos y usos de los mismos.

Antecedentes de la invención

Los ácidos grasos son ácidos carboxílicos con grupos laterales hidrocarbonados de cadena larga y juegan un papel fundamental en muchos procesos biológicos. Los ácidos grasos raramente se encuentran libres en la naturaleza, pero, además, se presentan en forma esterificada como componente principal de lípidos. Los lípidos/ácidos grasos son fuentes de energía (por ejemplo, b-oxidación) y son parte integral de membranas celulares que son indispensables para el procesamiento de información bioquímica o biológica.

Los ácidos grasos se pueden dividir en dos grupos: los ácidos grasos saturados y los ácidos grasos insaturados que contienen uno o más dobles enlaces de carbono en configuración cis. Los ácidos grasos insaturados se producen por medio de desaturasas terminales que pertenecen a la clase de enzimas de hierro no hemo. Cada una de estas enzimas hace parte de un sistema de transporte de electrones que contiene otras dos proteínas, a saber citocromo b₅ y NADH-citocromo b₅ reductasa. Específicamente, tales enzimas catalizan la formación de enlaces dobles entre los átomos de carbono de una molécula de ácido graso. Los humanos y otros mamíferos tienen un espectro limitado de esas desaturasas que son requeridas para la formación de enlaces dobles particulares en ácidos grasos insaturados. Por lo tanto, los humanos tienen que ingerir algunos ácidos grasos a través de su dieta. Tales ácidos grasos esenciales son, por ejemplo, ácido linoléico (C18:2); ácido linolénico (C18:3); ácido araquidónico (C20:4). En contraste, los insectos y las plantas son capaces de sintetizar una variedad mucho mayor de ácidos grasos insaturados y sus derivados.

Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (los LCPUFA) tales como el ácido docosahexanóico (DHA, 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19)) son componentes esenciales de las membranas celulares de diferentes tejidos y organelos en mamíferos (células nerviosas, de retina, de cerebro e inmunes).Por ejemplo, más del 30% de los ácidos grasos en los fosfolípidos del cerebro son 22:6 (n-3) y 20:4 (n-6). (Crawford, M. A., y colaboradores (1997) Am. J-Clin. Nutr. 66:1032S-1041S). En la retina, DHA representa más del 60% de los ácidos grasos totales en el segmento externo de la barra, la parte fotosensible de la célula fotorreceptora (Giusto, N. M., y colaboradores (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315-391). Estudios clínicos han mostrado que DHA es esencial para el crecimiento y desarrollo del cerebro de los bebes, y para el mantenimiento de la función normal del cerebro en adultos (Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120: S129-S138). DHA también tiene efectos significativos sobre la función fotorreceptora involucrada en el proceso de transducción de la señal, activación de la rodopsina, y el desarrollo de conos y bastones (Giusto, N. M., y colaboradores (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315-391). Además, también se encontraron algunos efectos positivos del DHA sobre enfermedades tales como hipertensión, artritis, aterosclerosis, depresión, trombosis y cánceres (Horrocks, L. A. y Yeo, Y. K. (1999) Pharmacol. Res. 40: 211-215). Por lo tanto, el suministro apropiado en la dieta del ácido graso es importante para los humanos para permanecer saludables. Es particularmente importante para los bebes, niños pequeños y adultos mayores la ingesta adecuada de estos ácidos grasos a partir de la dieta ya que no pueden ser eficientemente sintetizados en sus organismos y deben ser suministrados con la alimentación (Spector, A. A. (1999) Lipids 34: S1-S3).

El DHA es un ácido graso de la serie n-3 de acuerdo con la ubicación del último doble enlace en el extremo del metilo. Se sintetiza a través de etapas alternantes de desaturación y alargamiento. Comenzando con 18:3 (9, 12, 15), la biosíntesis del DHA involucra desaturación ?6 hasta 18:4 (6, 9, 12, 15), seguido por alargamiento hasta 20:4 (8, 11, 14, 17) y desaturación ?5 hasta 20:5 (5, 8, 11, 14, 17). Más allá de este punto, existen algunas controversias acerca de la biosíntesis. El punto de vista convencional es de que 20:5 (5,8,11,14,17) se alarga hasta 22:5 (7, 10, 13, 16, 19) y luego se convierte hasta 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19) por medio de la desaturación final ?4 (Horrobin, D. F. (1992) Prog. Lipid Res. 31: 163-194). Sin embargo, Sprecher y colaboradores recientemente sugirieron una ruta alternativa para la biosíntesis del DHA, que es independiente de la desaturasa ?4, que involucra dos alargamientos consecutivos, una desaturación ?6 y un acortamiento de dos carbonos a través ß-oxidación limitada en peroxisomas (Sprecher, H., y colaboradores (1995) J. Lipid Res. 36: 2471-2477; Sprecher, H., y colaboradores (1999) Lipids 34: S153-S156).

La producción del DHA es importante debido a su efecto benéfico sobre la salud humana. Actualmente las fuentes principales del DHA son aceites de pescado y de algas. El aceite de pescado es una fuente principal y tradicional para esta ácido graso, sin embargo, usualmente está oxidado al momento de su venta. Además, el suministro del aceite es altamente variable y su fuente está en peligro con la disminución de las poblaciones de peces mientras que la fuente de algas es costosa debido al bajo rendimiento y a los altos costos de extracción.

EPA y AA son ambos ácidos grasos esenciales ?5. Ellos forman una clase única de constituyentes alimenticios y de pienso para humanos y animales. EPA pertenece a la serie n-3 con cinco dobles enlaces en la cadena acilo, se encuentra en el alimento de mar y es abundante en pescado azul el Atlántico Norte. AA pertenece a la serie n-6 con cuatro dobles enlaces. La carencia de un doble enlace en la posición ?-3 confiere sobre AA propiedades diferentes a aquella encontradas en EPA. Los eicosanoides producidos a partir de AA tienen fuertes propiedades inflamatorias y de agregación plaquetaria, mientras que aquellos derivados de EPA tienen propiedades antiinflamatorias y de anti agregación plaquetaria. Los AA se pueden obtener a partir de algunos alimentos tales como carne, pescado, y huevos, pero la concentración es baja.

El ácido gama-linolénico (GLA) es otro ácido graso esencial encontrado en los mamíferos. El GLA es el intermediario metabólico para los ácidos grasos n-6 de cadena muy larga y para diferentes moléculas activas. En mamíferos, la formación de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga está limitada en velocidad por la desaturación ?6. Muchas condiciones fisiológicas y patológicas tales como el envejecimiento, el estrés, la diabetes, el eczema, y algunas infecciones se ha demostrado que deprimen la etapa de desaturación ?6. Además, el GLA es fácilmente catabolizado a partir de la oxidación y rápida división celular asociada con ciertos trastornos, por ejemplo, cáncer o inflamación. Por lo tanto, la suplementación de la dieta con GLA puede reducir los riesgos de estos trastornos. Los estudios clínicos han mostrado que la suplementación de la dieta con GLA es efectiva en el tratamiento de algunas condiciones patológicas tales como eczema atópico, síndrome premenstrual, diabetes, hipercolesterolemia, y trastornos inflamatorios y cardiovasculares.

Las fuentes predominantes de GLA son aceites de plantas tales como onagra (Oenothera bienins) borraja (Borago officinalis L.), grosella negra (Ribes nigrum), y a partir de microorganismos tales como Mortierella sp., Mucor sp., y Cyanobacteria. Sin embargo, estas fuentes de GLA no son ideales para suplementación de la dieta debido a grandes fluctuaciones en la disponibilidad y en los costos asociados con procesos de extracción.

Resumen de la invención

La biosíntesis de ácidos grasos es una actividad principal de las plantas y de los microorganismos. Sin embargo, los humanos tienen una capacidad limitada para sintetizar ácidos grasos esenciales, por ejemplo ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (los LCPUFA). La biotecnología ha sido considerada con mucho una forma eficiente para manipular el proceso de producción de ácidos grasos en plantas y microorganismos. Es rentable y renovable con pocos efectos secundarios. En consecuencia, se ha producido un tremendo esfuerzo industrial dirigido a la producción de diferentes compuestos incluyendo especialmente ácidos grasos y polipéptidos farmacéuticos a través de la manipulación de células de plantas, animales y microorganismos. Por lo tanto, la biotecnología es una ruta atractiva para la producción de ácidos grasos insaturados especialmente los LCPUFA, en una forma segura y rentable para acumular...

1. Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de:

2. Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de:

3. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2.

4. El vector de la reivindicación 3, que es un vector de expresión.

5. Una célula huésped transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 4.

6. La célula huésped de la reivindicación 5, en donde la célula es seleccionada del grupo que consiste de una célula vegetal, una célula microbiana, y una célula animal.

7. La célula huésped de la reivindicación 6, en donde la célula vegetal es de una planta de semillas oleaginosas seleccionada del grupo que consiste de lino (Linum sp.), colza (Brassica sp.), soja (Glycine y Soja sp.), girasol (Helianthus sp.), algodón (Gosssypium sp.), maíz (Zea mays), oliva (Olea sp.), cártamo (Carthamus sp.), cacao (Theobroma cacoa), y maní (Arachis sp.).

8. La célula huésped de la reivindicación 6, en donde la célula microbiana es selecciona del grupo que consiste de Thraustochytrium, Pythium irregulare, Schizichytrium, y Crythecodinium.

9. Un método para producir un polipéptido que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 5 para producir el polipéptido.

10. Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de:

11. El polipéptido aislado de la reivindicación 10 que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 ó 4.

12. Un método para transformar un ácido graso insaturado que comprende transfectar o transformar una célula con la molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2 y cultivar la célula bajo condiciones tales que se produzca el ácido graso insaturado.

13. El método de la reivindicación 12, en donde se selecciona la célula del grupo que consiste de una célula vegetal, una célula animal, y una célula microbiana.

14. El método de la reivindicación 13, en donde la célula vegetal es seleccionada de una planta de semillas oleaginosas.

15. El método de la reivindicación 14, en donde se selecciona la planta de semillas oleaginosas del grupo que consiste de lino (Linum sp.), colza (Brassica sp.), soja (Glycine y Soja sp.), girasol (Helianthus sp.), algodón (Gosssypium sp.), maíz (Zea mays), oliva (Olea sp.), cártamo (Carthamus sp.), cacao (Theobroma cacoa), y maní (Arachis sp.).

16. El método de la reivindicación 12, que comprende además la etapa de recuperación del ácido graso insaturado.

17. El método de la reivindicación 12, en donde se selecciona el ácido graso insaturado del grupo que consiste de AA 20:4 (5, 8, 11, 14), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16), y DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19).

18. Un método para producir un ácido graso insaturado que comprende poner en contacto una composición que contiene al menos una molécula objetivo de desaturasa con al menos un polipéptido aislado de la reivindicación 10 u 11 bajo condiciones tales que se produce el ácido graso insaturado.

19. El método de la reivindicación 18, que comprende además la etapa de recuperación del ácido graso insaturado.

20. El método de la reivindicación 18, en donde se selecciona al ácido graso insaturado del grupo que consiste de AA 20:4 (5, 8, 11, 14), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16), y DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19).

21. Un método para producir una célula vegetal o microbiana capaz de generar un ácido graso insaturado que comprende, la introducción en dicha célula de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2, en donde la molécula de ácido nucleico codifica una desaturasa que tiene actividad para catalizar la formación de un doble enlace en una cadena acilo grasa.

22. El método de la reivindicación 21, en donde la célula es una célula vegetal.

23. El método de la reivindicación 22, en donde la célula vegetal es de una planta de semillas oleaginosas.

24. El método de la reivindicación 23, en donde la planta de semillas oleaginosas es lino (Linum sp.), colza (Brassica sp.), soja (Glycine y Soja sp.), girasol (Helianthus sp.), algodón (Gosssypium sp.), maíz (Zea mays), oliva (Olea sp.), cártamo (Carthamus sp.), cacao (Theobroma cacoa), y maní (Arachis sp.).

25. El método de la reivindicación 21, en donde se selecciona al ácido graso insaturado del grupo que consiste de AA 20:4 (5, 8, 11, 14), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16), y DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19).

26. Un método para modular la producción de un ácido graso insaturado que comprende el cultivo de la célula de la reivindicación 5, de tal manera que ocurre la modulación de la producción de un ácido graso insaturado.

27. El método de la reivindicación 26, en donde se refuerza la producción del ácido graso insaturado.

28. El método de la reivindicación 26, en donde se selecciona al ácido graso insaturado del grupo que consiste de AA 20:4 (5, 8, 11, 14), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16), y DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19).

29. El método de la reivindicación 26, que comprende además la recuperación del ácido graso insaturado.

30. Un método para la producción a gran escala de un ácido graso insaturado, que comprende el cultivo de la célula de la reivindicación 5, de tal manera que se produce el ácido graso insaturado.

31. El método de la reivindicación 30, en donde se refuerza la producción del ácido graso insaturado.

32. El método de la reivindicación 30, en donde se selecciona al ácido graso insaturado del grupo que consiste de AA 20:4 (5, 8, 11, 14), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16), y DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19).

33. El método de la reivindicación 28, que comprende además la recuperación del ácido graso insaturado.

34. Una composición que comprende al polipéptido de la reivindicación 10 u 11.

35. Un método para producir un suplemento dietético que comprende al método de la reivindicación 12, 18, 26 ó 30.

36. Una composición que comprende a la célula producida por medio del método de la reivindicación 21.

37. La composición de la reivindicación 34, en donde se utiliza la composición en alimento para animales.

38. Un método de acuerdo a la reivindicación 35, en donde el suplemento dietético es suplemento para animales.

39. Un suplemento dietético que comprende a la composición de la reivindicación 34.

40. Un método para suplementar la dieta de un humano o de un animal, que comprende la adición de la composición de la reivindicación 34.