SEPARACION DE POLIPEPTIDOS COMPRENDIENDO UN AMINOACIDO RACEMIZADO.

Método para separar las dos formas de un polipéptido que tiene una única racemización de aminoácido,

donde las dos formas de un polipéptido que tiene una única racemización de aminoácido son A(X) y A(X*), donde

X es un L-aminoácido,

A(X) es un polipéptido que comprende el aminoácido X,

X* es el D-isómero de X,

A(X*) es un polipéptido que comprende el aminoácido X* pero por el contrario idéntico a A(X), dicho método caracterizado por el hecho de ser un proceso de cromatografía de intercambio de iones comprendiendo la elución mediante el aumento de la concentración de sal a un pH que es no mayor de 1 unidad de pH de una pKa de X bajo las condiciones de elución

Separación de polipéptidos comprendiendo un aminoácido racemizado.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de purificación de proteína. En particular, la invención se refiere a un método para separar polipéptidos donde un aminoácido es racemizado.

Antecedentes de la invención

Los polipéptidos están siendo usados cada vez más como medicamentos para el tratamiento de enfermedades en todas las principales áreas de terapia. El tratamiento de la diabetes por administración crónica de insulina ha sido practicada durante más de 80 años, y usos terapéuticos de polipéptidos en trastornos del crecimiento y cáncer también han sido practicados durante muchos años.

Procesos económicos para la producción a gran escala de polipéptidos con una pureza suficientemente alta para usos terapéuticos son cruciales para que las terapias adicionales basadas en polipéptidos alcancen el mercado masivo y para que las terapias existentes se vuelvan mucho más usadas.

Los polipéptidos para aplicaciones terapéuticas deben ser altamente purificados para ser eficaces y para proporcionar la certeza de no provocar eventos adversos al administrarse a pacientes. Varias fases de tratamiento usadas en la síntesis y purificación de polipéptidos son conocidas por causar la racemización de uno o más residuos de aminoácidos en el polipéptido objetivo. Normalmente, estas condiciones son pH extremos y temperaturas altas, p. ej. valores de pH encima de pH 12 (Senderoff et al. J. Pharm. Sci. 87, 183-189 (1998)). Las variantes de polipéptidos que tienen un residuo de aminoácido racemizado son capaces de separación e identificación por técnicas analíticas del estado de la técnica. Estas variantes son indeseables en polipéptidos para uso terapéutico debido a preocupaciones de toxicidad y porque éstas pueden tener actividad diferente que el polipéptido deseado. No obstante, es un desafío serio el hecho de separar estos polipéptidos cercanamente relacionados en la escala preparatoria, es decir, durante la producción industrial.

La purificación de un polipéptido de una mezcla es una fase que es normalmente usada varias veces durante el proceso de fabricación global para un polipéptido terapéutico. La cromatografía de intercambio de iones es frecuentemente aplicada en las fases de separación temprana y en bruto, mientras que la cromatografía en fase líquida de alta presión de fase inversa (RP-HPLC) es el método preferido para la separación industrial de alta resolución de polipéptidos relacionados en las fases de purificación finales. RP-HPLC ha demostrado ser versátil para la purificación a gran escala de muchos polipéptidos pero el proceso es relativamente caro y tiene capacidad limitada.

Stueber W. et al. (Int. J. Peptide Protein Res., 22, 277-283 (1983)) expone la purificación del péptido de insulina bovina B_20-30 por cromatografía de intercambio de iones usando una elución de gradiente con acetato amónico y Senderoff et al. (J. Pharm. Sci., 87, 183-186 (1998)) expone la purificación de GLP-1 por cromatografía de intercambio de cationes.

Hemos descubierto sorprendentemente un proceso de intercambio de iones que puede separar los dos polipéptidos variando el resultado cuando la racemización de un residuo de aminoácido ha tomado posición. El método es capaz de operación a gran escala y proporciona una fase de purificación económica con alta capacidad.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Cromatograma de AU₂₈₀ versus tiempo (min) de una separación. Pico nº. 1 es la variante D-his, D-His⁷ Arg³⁴Lys²⁶N^varepsilon(?-Glu(N^a-hexadecanoil))GLP-1_(7-37), Pico nº. 2 es Arg³⁴Lys²⁶N^varepsilon(?-Glu(N^a-hexadecanoil))GLP-1_(7-37).

Figura 2. Cromatograma de AU₂₈₀ versus tiempo (min) de una separación. Tanto D-His⁷Arg³⁴Lys²⁶N^varepsilonE(?-Glu(N^a-hexadecanoil))GLP-1_(7.37) como Arg³⁴Lys²⁶N^varepsilon(?-Glu(N^a-hexadecanoil))GLP-1_(7-37) eluye el pico en su mayor parte. La variante D-His es altamente concentrada en el borde delantero del pico principal y puede ser separada con pérdida baja de rendimiento por fraccionamiento o corte del pico.

Figura 3. Cromatograma de AU₂₁₅ versus volumen (ml) de una separación. Pico nº. 1 contiene la variante L-His de Exendina-4, Pico nº. 2 contiene la variante D-His de Exendina-4.

Definiciones

La siguiente es una definición detallada de los términos usados en la especificación.

El término "tampón" como se utiliza en este caso se refiere a un compuesto químico que reduce la tendencia del pH de una solución tal como soluciones cromatográficas a cambiar con el tiempo como ocurriría en caso contrario. Los tampones incluyen los ejemplos siguientes no limitativos: acetato sódico, carbonato sódico, citrato sódico, glicil-glicina, glicina, histidina, lisina, fosfato sódico, borato, tris-hidroximetil-aminometano, etanolamina y sus mezclas derivadas.

El término "modificador orgánico" como se utiliza en este caso se refiere a un mineral orgánico que se añade a soluciones cromatográficas. Modificadores orgánicos pueden ser alcoholes monohídricos, alcoholes polihídricos al igual que nitritos y cetonas. Ejemplos no limitativos de modificadores orgánicos son metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, t-butanol, hexilenglicol (4-metil-2,4-pentanodiol), neopentil alcohol (2,2-dimetol-1,3- propanodiol), acetonitrilo, acetona y úrea.

El término "polipéptido" como se utiliza en este caso significa un compuesto compuesto por al menos cinco aminoácidos constituyentes conectados por enlaces peptídicos. Los aminoácidos constituyentes pueden ser del grupo de los aminoácidos codificados por el código genético y pueden ser aminoácidos naturales que no son codificados por el código genético, al igual que los aminoácidos sintéticos. Aminoácidos naturales que no son codificados por el código genético son p. ej. hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, D-alanina y D-glutamina. Aminoácidos sintéticos comprenden aminoácidos fabricados por síntesis química, es decir D-isómeros de los aminoácidos codificados por el código genético tal como D-alanina y D-leucina, Aib (ácido a-aminoisobutírico), Abu (ácido a-aminobutirico), Tle (terc-butilglicina), y ß-alanina. Un polipéptido puede comprender una única cadena peptídica o puede comprender más de una cadena peptídica, tal como p. ej. insulina humana donde dos cadenas son conectadas por enlaces disulfuro.

El término "péptido tipo glucagón" como se utiliza en este caso se refiere a las exendinas y péptidos homólogos además del glucagón que son derivados del gen de preproglucagón, es decir péptido 1 de tipo glucagón (GLP-1), péptido 2 de tipo glucagón (GLP-2), y oxintomodulina (OXM) al igual que análogos y derivados de los mismos. Los péptidos derivados del gen de preproglucagón son glucagón, péptido 1 de tipo glucagón (GLP-1), péptido 2 de tipo glucagón (GLP-2) y oxintomodulina (OXM). Las exendinas que se encuentran en el monstruo de Gila son homologas a GLP-1 y también ejercen un efecto insulinotrópico. Ejemplos de exendinas son exendina-4 y exendina-3.

Los péptidos de tipo glucagón tienen las secuencias siguientes (SEC ID Nos. 1-6):

El término "análogo" como se utiliza en este caso en referencia a un péptido significa un péptido modificado donde uno o más residuos de aminoácidos del péptido han sido sustituidos por otros residuos de aminoácidos y/o donde uno o más residuos de aminoácidos han sido delecionados del péptido y/o donde uno o más residuos de aminoácidos han sido delecionados del péptido y/o donde uno o más residuos de aminoácidos han sido añadidos al péptido. Esta adición o eliminación de residuos de aminoácidos puede tener lugar en el N-terminal del péptido y/o en el C-terminal del péptido. Dos sistemas diferentes y simples son frecuentemente usados para describir los análogos: por ejemplo Arg³⁴-GLP-1(7-37) o K34R-GLP-1(7-37) designa un análogo de GLP-1 donde la lisina que se origina de forma natural en la posición 34 ha sido sustituida con arginina (abreviatura estándar de una sola letra para aminoácidos usados según la nomenclatura...

1. Método para separar las dos formas de un polipéptido que tiene una única racemización de aminoácido, donde las dos formas de un polipéptido que tiene una única racemización de aminoácido son A(X) y A(X*), donde

X es un L-aminoácido,

A(X) es un polipéptido que comprende el aminoácido X,

X* es el D-isómero de X,

A(X*) es un polipéptido que comprende el aminoácido X* pero por el contrario idéntico a A(X), dicho método caracterizado por el hecho de ser un proceso de cromatografía de intercambio de iones comprendiendo la elución mediante el aumento de la concentración de sal a un pH que es no mayor de 1 unidad de pH de una pKa de X bajo las condiciones de elución.

2. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho método es para separar dichos polipéptidos en la escala preparatoria.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la elución se realiza a un pH que es sustancialmente el mismo que el pH usado para la unión.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la unión de los polipéptidos se realiza a un pH que es no mayor de aproximadamente 0.5 unidades de pH de una pKa de X bajo las condiciones de elución.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha elución se realiza a un pH que es superior al punto isoeléctrico de dichos polipéptidos.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho polipéptido tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 10 kDa.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el eluyente comprende un modificador orgánico.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el eluyente comprende un modificador orgánico en una concentración suficiente para mantener dichos polipéptidos solubles.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde dicho modificador orgánico es etanol.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde dicho modificador orgánico es 2-propanol.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde dicho modificador orgánico es acetonitrilo.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde dicho modificador orgánico es seleccionado del grupo que consiste en metanol, 1-propanol y hexilenglicol.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-12, donde la concentración de dicho modificador orgánico es de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 80%, tal como de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 70%, o de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 65%.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha sal es seleccionada del grupo que consiste en cloruro sódico, sulfato de sodio, acetato sódico, cloruro potásico, sulfato potásico, y acetato potásico.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde X es el residuo de aminoácido N-terminal o el C-terminal.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde X es L-histidina.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde X es un análogo de aminoácido de histidina.

18. Método según la reivindicación 17, donde X es seleccionado del grupo que consiste en desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina y a-metil-histidina.

19. Método según la reivindicación 17 o 18, donde X es el residuo de aminoácido N-terminal.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde X es L-fenilalanina.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho polipéptido es un péptido de tipo glucagón.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho polipéptido es glucagón, un análogo de glucagón, un derivado de glucagón o un derivado de un análogo de glucagón.

23. Método según la reivindicación 21, donde dicho polipéptido es GLP-1, un análogo de GLP-1, un derivado de GLP-1 o un derivado de un análogo de GLP-1.

24. Método según la reivindicación 23, donde dicho análogo de GLP-1 es seleccionado del grupo que consiste en Arg³⁴-GLP-1(7-37), Gly⁸-GLP-1(7-36)-amida, Gly⁸-GLP-1(7-37), Val⁸-GLP-1(7-36)-amida, Val⁸-GLP-1(7-37), Val⁸Asp²²-GLP-1(7-36)-amida, Val⁸Asp²²-GLP-1(7-37), Val⁸-Glu²²-GLP-1(7-36)-amida, Val⁸Glu²²-GLP- 1(7-37), Val⁸Lys²²-GLP-1(7-36)-amida, Val⁸Lys²²-GLP-1(7-37), Val⁸Arg²²-GLP-1(7-36)-amida, Val⁸Arg²²-GLP-1(7-37), Val⁸His²²-GLP-1(7-36)-amida, Val⁸His²²-GLP-1(7-37), Val⁸Trp¹⁹Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²Val²⁵-GLP-1(7-37), Val⁸Tyr¹⁶Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Trp¹⁶Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Leu¹⁶Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Tyr¹⁸Glu²²-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²His³⁷-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²Ile³³-GLP-1(7-37), Val⁸Trp¹⁶Glu²²Val²⁵Ile³³-GLP-1(7-37), Val⁸Trp¹⁶ Glu²²Ile³³-GLP-1(7-37), Val⁸Glu²²Val²⁵Ile³³-GLP-1(7-37), Val⁸Trp¹⁶Glu²²Val²⁵-GLP-1(7-37), análogos y derivados de cualquiera de estos.

25. Método según la reivindicación 23, donde dicho derivado de GLP-1 o un derivado de un análogo de GLP-1 tiene un residuo de lisina, tal como una lisina, donde un sustituyente lipofílico se fija opcionalmente por medio de un separador al grupo epsilon amino de dicha lisina.

26. Método según la reivindicación 25, donde dicho sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de carbono, preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a 18 átomos de carbono.

27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 25-26, donde dicho separador está presente y se selecciona de un aminoácido, p. ej. beta-Ala, L-Glu, o aminobutiroilo.

28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 21-27, donde dicho péptido de tipo glucagón es un péptido tipo glucagón protegido con DPPIV.

29. Método según cualquiera de las reivindicaciones 21-28, donde dicho péptido de tipo glucagón es un péptido de tipo glucagón estable en plasma.

30. Método según la reivindicación 23, donde dicho derivado de un análogo de GLP-1 es Arg³⁴, Lys²⁶N^varepsilon(?-Glu(N^a-hexadecanoil)))-GLP-1(7-37).

31. Método según cualquiera de las reivindicaciones 22-30, donde dicho péptido de tipo glucagón tiene de 22 a 40 residuos de aminoácidos, preferible de 26 a 36 residuos de aminoácidos, incluso más preferible de 29 a 33 residuos de aminoácidos.

32. Método según la reivindicación 21, donde dicho péptido de tipo glucagón es GLP-2, un análogo de GLP-2, un derivado de GLP-2 o un derivado de un análogo de GLP-2.

33. Método según la reivindicación 32, donde dicho derivado de GLP-2 o un derivado de un análogo de GLP-2 tiene un residuo de lisina, tal como una lisina, donde un sustituyente lipofílico se fija opcionalmente por medio de un separador al grupo epsilon amino de dicha lisina.

34. Método según la reivindicación 33, donde dicho sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de carbono, preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a 18 átomos de carbono.

35. Método según cualquiera de las reivindicaciones 33-34, donde dicho separador está presente y se selecciona de un aminoácido, p. ej. beta-Ala, L-Glu, aminobutiroilo.

36. Método según cualquiera de las reivindicaciones 32-35, donde dicho péptido de tipo glucagón tiene de 27 a 39 residuos de aminoácidos, preferible de 29 a 37 residuos de aminoácidos, incluso más preferible de 31 a 35 residuos de aminoácidos.

37. Método según las reivindicaciones 21 o 32, donde dicho péptido de tipo glucagón es Lys¹⁷Arg³⁰-GLP-2(1-33) o Arg³⁰Lys¹⁷N^varepsilon(ß-Ala(N^a-hexadecanoil))GLP-2(1-33).

38. Método según las reivindicaciones 21 o 32, donde dicho péptido de tipo glucagón es Gly²-GLP-2(1-33).

39. Método según la reivindicación 21, donde dicho péptido de tipo glucagón es exendina-4, un análogo de exendina-4, un derivado de exendina-4, o un derivado de un análogo de exendina-4.

40. Método según la reivindicación 39, donde dicho péptido de tipo glucagón es exendina-4.

41. Método según la reivindicación 39, donde dicho péptido de tipo glucagón es ZP10, es decir HGEGTFTSDLSK QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2.

42. Método según la reivindicación 39, donde dicho derivado de exendina-4 o derivado de un análogo de exendina-4 es un péptido adiado o un péptido pegilado.

43. Método según la reivindicación 39, donde dicho derivado de exendina-4 o derivado de un análogo de exendina-4 tiene un residuo de lisina, tal como una lisina, donde un sustituyente lipofílico opcionalmente por medio de un separador se fija al grupo epsilon amino de dicha lisina.

44. Método según la reivindicación 43, donde dicho sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de carbono, preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a 18 átomos de carbono.

45. Método según cualquiera de las reivindicaciones 43-44, donde dicho separador está presente y se selecciona de un aminoácido, p. ej. beta-Ala, L-Glu, o aminobutiroilo.

46. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-20, donde dicho polipéptido es un péptido de insulina.

47. Método según la reivindicación 46, donde dicho péptido de insulina es insulina humana, un análogo de insulina humana, un derivado de insulina humana o un derivado de un análogo de insulina humana.

48. Método según la reivindicación 47, donde dicho péptido de insulina es insulina humana.

49. Método según la reivindicación 47, donde dicho análogo de insulina humana es seleccionado del grupo que consiste en Asp^B28-insulina humana, Lys^B28Pro^B29-insulina humana, Lys^B3Glu^B29-insulina humana, Gly^A21Arg^B31 Arg^B32-insulina humana, y des(B30) insulina humana.

50. Método según la reivindicación 47, donde dicho derivado de insulina humana o dicho derivado de un análogo de insulina humana tiene un residuo de lisina, tal como una lisina, donde un sustituyente lipofílico opcionalmente por medio de un separador se fija al grupo epsilon amino de dicha lisina.

51. Método según la reivindicación 50, donde dicho sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de carbono, preferiblemente de 8 a 24, por ejemplo 12-18.

52. Método según cualquiera de las reivindicaciones 50-51, donde dicho separador está presente y se selecciona de un aminoácido, por ejemplo. beta-Ala, L-Glu, aminobutiroilo.

53. Método según cualquiera de las reivindicaciones 50-52, donde dicho derivado de un análogo de insulina humana es N^{varepsilon B29}-Tetradecanoil des(B30) insulina humana o N^{varepsilon B29}-litocoloil-?-glutamil des(B30) insulina humana.

54. Método según cualquiera de las reivindicaciones 46-53, donde X es L-fenilalanina en la posición 1 en la B-cadena del péptido de insulina.