Sensor fluorescente y su uso para la detección de inhibidores de kinasas dependientes de ciclinas y/o para la detección de ciclinas.

La presente invención se refiere a un sensor fluorescente que comprende un quelatante de lantánido y una secuencia peptídica, así como su método de obtención y su uso para la identificación de inhibidores de complejos CDK/ciclinas (kCDKCs) y la detección y cuantificación in vitro de la proteína ciclina. Además, se refiere a un kit para implementar la identificación de inhibidores de kCDKCs así como la detección y cuantificación de ciclina en una muestra

Sensor fluorescente y su uso para la detección de inhibidores de kinasas dependientes de ciclinas y/o para la detección de ciclinas.

La presente invención se refiere a un sensor fluorescente que comprende un quelatante de lantánido y una secuencia peptídica, así como su método de obtención y su uso para la identificación de inhibidores de complejos CDK/ciclinas (kCDKCs) y la detección y cuantificación in vitro de la proteína ciclina. Además, se refiere a un kit para implementar la identificación de inhibidores de kCDKCs y así como la detección y cuantificación de ciclina en una muestra.

Estado de la técnica anterior

La división celular (mitosis) es uno de los requisitos necesarios para el desarrollo de los organismos multicelulares. La capacidad de una célula de dividirse y diferenciarse permite la creación de estructuras multicelulares complejas. Cuando hay un fallo en el mecanismo de regulación del ciclo celular puede tener lugar una proliferación celular excesiva capaz de producir cáncer. En células eucariotas, el ciclo celular está regulado por varios complejos de kinasas formados por la asociación de una unidad de kinasa (CDK) con una unidad reguladora de la proteína ciclina (Poon, R. Y. C. Cell. Mol. Life Sci. 2002, 59, 1317-1326). Los complejos kinasas CDK-Ciclina (kCDKC) son a su vez regulados por mecanismos de fosforilación y por interacciones con distintas proteínas. En los últimos 10 años se han publicado más de 80.000 artículos relacionados con ciclinas, lo que da una idea de la importancia biológica y médica de estas proteínas.

La evidencia genética demuestra una fuerte correlación entre alteraciones en la regulación de kCDKCs y la patología molecular del cáncer (Deshpande, A. et al. Oncogene 2005, 24, 2909-2915), y es por ello que en los últimos años ha habido un gran interés en el desarrollo de inhibidores de kCDKCs. Una de las estrategias para la obtención de estos inhibidores consiste en el diseño de derivados peptídicos, con un modo de unión a la ciclina, análogo al de la proteína inhibidora p27/Kip1, y que sean capaces de interferir con el proceso de reconocimiento de los sustratos naturales del complejo kCDKC. El sitio de unión de p27/Kip1 a la ciclina está definido por una secuencia específica conocida como CBM (Cyclin Binding Motif). Estudios biológicos con distintos péptidos conteniendo el CBM han demostrado su capacidad de interferir en la formación de complejos estables de proteínas con kCDKCs, y de esta forma inducir apoptosis en células tumorales in vitro e in vivo (McInnes, C. et al. Curr. Med. Chem. Anti-Cancer Agents 2003, 3, 57-69; Mendoza, N. et al. Cancer Res. 2003, 63, 1020-1024).

La relevancia biológica del sistema de kCDKC hace especialmente interesante la obtención de sensores de ciclina, sustancias capaces de interaccionar específicamente con la ciclina y producir una señal susceptible de ser medida espectroscópicamente. Estos sensores representarían una nueva herramienta para el estudio de los mecanismos moleculares implicados en el control del ciclo celular dependientes de la ciclina, y servirían como instrumento para la identificación de nuevos inhibidores de kCDKCs con posibles aplicaciones farmacológicas mediante el desarrollo de ensayos competitivos.

La espectroscopia de fluorescencia ofrece numerosas ventajas para el desarrollo de sensores y de sistemas de diagnóstico debido a su sensibilidad y a la facilidad de los ensayos. Existen diversas estrategias para el diseño de sensores que aprovechan diferentes mecanismos implicados en el fenómeno de la fluorescencia. Una de las más interesantes se basa en la utilización de complejos fluorescentes de lantánidos debido a sus especiales características: un tiempo de vida excepcionalmente largo (milisegundos) y bandas de emisión extremadamente estrechas, que permiten una mejor resolución de su señal de fluorescencia independientemente de la dispersión y del fondo de autofluorescencia en mezclas biológicas.

Los lantánidos trivalentes emiten fluorescencia por transiciones entre orbitales 4f, estas transiciones son prohibidas por las reglas de selección, y por lo tanto presentan un coeficiente de absorción extremadamente bajo (menor de 10 M^-1 cm^-1), lo que hace que los lantánidos trivalentes no se puedan excitar directamente por métodos normales. Para solucionar este problema se recurre a un método de excitación indirecta conocido como sensibilización (sensitization) o efecto antena (Gunnlaugsson, T. et al. Org. Biomol. Chem. 2007, 5, 1999-2009). La sensibilización genera la fluorescencia del catión Ln(III) en un proceso de tres etapas: i) la luz es absorbida en el entorno inmediato del Ln(III) por un cromóforo orgánico (antena); ii) la energía de excitación se transfiere desde el cromóforo orgánico a uno o varios de los estados excitados del ión metálico y finalmente; iii) se produce la emisión luminiscente por parte del metal. Es importante resaltar que en el proceso de sensibilización no es necesaria la unión directa de la antena con el centro metálico, sino sólo la proximidad en el espacio. Este proceso puede tener lugar de manera eficiente si ambas especies se encuentran a menos de 15-20 Å.

En el diseño de sondas basadas en la emisión de los lantánidos se intentan modular las propiedades luminiscentes de los iones Ln(III) por procesos que dependan de la concentración de un analito. Esta modulación puede ser efectuada utilizando el analito como especie sensibilizadora de un complejo no fluorescente o poco fluorescente. Existen precedentes de la aplicación de esta estrategia en sensores de moléculas poliaromáticas basados en complejos de Tb(III) con una unidad de ciclodextrina-DTPA (dietiltetraminopentaacetato) no fluorescentes. La transferencia eficiente de energía desde las moléculas aromáticas al Ln(III) se produce cuando éstas se unen a la ciclodextrina. A pesar de todo, este principio ha sido aún poco explotado en el diseño de sensores y los ejemplos de su aplicación a sistemas biológicos son muy escasos (Leonard, J. P. et al. Chem. Commun. 2007, 129-131).

A pesar de la existencia de algunos sensores, éstos no se han empleado para detectar ciclina e inhibidores de kCDKCs del modo expuesto en esta invención.

Actualmente y a pesar de la importancia biológica y la relevancia en diagnóstico de patologías relacionadas con ciclina, no existen ensayos simples para identificar posibles inhibidores. Normalmente se recurre a ensayos de microcalorimetría o bioquímicos, con los consiguientes problemas de reproducibilidad, implementación en ensayos de high-throughput o de actividad enzimática (Gondeau, C. et al. J. Biol. Chem. 2005, 280, 13793-13800).

Explicación de la invención

La presente invención se basa en el diseño de sensores que aprovechan, como se explica más adelante, diferentes mecanismos implicados en el fenómeno de la fluorescencia mediante la utilización de péptidos quelatantes de lantánido que permiten una buena resolución de su señal fluorescente. Estos sensores son capaces de mostrar la presencia de ciclina.

En este sentido, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un sensor fluorescente que comprende:

1. Sensor fluorescente que comprende,