Método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico, que comprende las etapas de:

(a) hibridar dos o más cebadores de secuenciación con una o una pluralidad de cadenas individuales de la molécula de ácido nucleico, en la que todos los cebadores excepto uno son cebadores reversiblemente bloqueados,

(b) incorporar por lo menos una base en la molécula de ácido nucleico mediante elongación de polimerasa a partir de un cebador no bloqueado,

(c) bloquear la elongación adicional de dicho cebador no bloqueado,

(d) desbloquear uno de los cebadores reversiblemente bloqueados, formando un cebador desbloqueado,

(e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que por lo menos uno de los cebadores reversiblemente bloqueados se haya desbloqueado y utilizado para determinar una secuencia mediante secuenciación pirofosfato

Secuenciación desde dos extremos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para secuenciar tanto la cadena sentido como la cadena antisentido de un ácido nucleico.

Antecedentes

La presente invención se refiere a un método para la secuenciación de las bases de ácido desoxirribonucleico (ADN). Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos para secuenciar tanto la cadena sentido como la cadena antisentido de ADN mediante la utilización de cebadores de secuenciación bloqueados y no bloqueados.

La secuenciación del genoma ofrece la posibilidad de diagnóstico, terapia y prevención de enfermedades, así como la modificación dirigida del genoma humano. Resultan necesarios métodos de secuenciación rápida que permitan la utilización de este potencial. La secuenciación de bases del ácido desoxirribonucleico (ADN) y del ácido ribonucleico (ARN) es una de las técnicas analíticas más importantes de la biotecnología, la industria farmacéutica, la industria alimentaria, el diagnóstico médico y otros campos de aplicación.

Se encuentran disponibles muchos métodos de secuenciación del ADN, tales como la secuenciación de Sanger utilizando la terminación dideoxi y la electroforesis en gel desnaturalizante (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:5463-5467, 1977), la secuenciación de Maxam-Gilbert utilizando el corte químico y la electroforesis en gel desnaturalizante (Maxam A.M. y Gilbert W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564, 1977), la pirosecuencación, mediante la detección del pirofosfato (PPi) liberado durante la reacción de la ADN polimerasa (Ronaghi M. et al., Science 281:363-365, 1998) y la secuenciación mediante hibridación (SBH) utilizando oligonucleótidos (Lysov I. et al., Dok1 Akad Nauk SSSR 303:1508-1511, 1988; Bains W. y Smith G.C., J. Theor. Biol. 135:303-307, 1988; Dmanac R. et al., Genomics 4:114-128, 1989; Khrapko K.R. et al., FEBS Lett. 256:118-122, 1989; Pevzner P.A., J. Biomol. Struct. Dyn. 7:63-73, 1989; Southern E.M. et al., Genomics 13:1008-1017, 1992).

Ronaghi et al. (Anal. Biochem. 267:65-71, 1999) se refieren a un método de secuenciación de ambas cadenas de un ácido nucleico. El método implica la amplificación por PCR de un ácido nucleico molde con un cebador biotinilado y un cebador no biotinilado. El producto amplificado, que comprende una cadena biotinilada y una cadena no biotinilada se separa en cadenas. Los autores se refieren a la utilización de perlas recubiertas con estreptavidina para la separación de cadenas. La cadena biotinilada queda unida a las perlas, mientras que la cadena no biotinilada se separa de la perla bajo condiciones desnaturalizantes. Las dos cadenas (biotinilada y no biotinilada) se secuencian separadamente. Al contrario que en la presente invención, que utiliza la secuenciación en fase sólida para ambas cadenas, dicho método utiliza la secuenciación en fase sólida para la cadena biotinilada y la secuenciación en fase solución para la secuencia de la cadena no biotinilada. Por lo tanto, el método de Ronaghi es similar al método tradicional de secuenciación del ADN que comprende la separación de las cadenas (por ejemplo utilizando un gel de urea) de un molde antes de la secuenciación. De esta manera, el método de Ronaghi adolece de la misma desventaja que los métodos tradicionales: el requisito de una etapa laboriosa de separación de cadenas y de aislamiento de las cadenas individuales antes de la secuenciación. Las desventajas del método de Ronaghi se incrementan geométricamente a medida que se incrementa el número de reacciones de secuenciación paralela. Por ejemplo, la secuenciación paralela de 1.000 moldes de doble cadena requeriría 1.000 separaciones y 2.000 aislamientos de cadenas individuales. Además, el método de Ronaghi, al igual que todos los métodos basados en la separación de cadenas, se limita a la determinación de secuencias a partir de dos cebadores (uno para cada cadena) por cada molde de doble cadena.

La secuenciación basada en el corte químico ha demostrado ser difícil de automatizar. Otros métodos de secuenciación son laboriosos debido a la necesidad de llevar a cabo una etapa de hibridación por cada esfuerzo de secuenciación. En muchas situaciones, la etapa de hibridación es la etapa limitante de la velocidad de una reacción de secuenciación.

Se han realizado intentos para llevar a cabo la secuenciación a partir de los dos extremos de un ácido nucleico, utilizando, por ejemplo, dos cebadores de secuenciación marcados diferentemente (por ejemplo Li-Cor, de Lincoln, Nebraska) en una reacción de secuenciación de Sanger (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:5463-5467, 1977). Estos métodos son variaciones de la secuenciación manual y requieren una etapa de fraccionamiento por tamaño (por ejemplo un gel) para determinar una secuencia. Aunque el fraccionamiento por tamaño puede resultar adecuado para tamaños de muestra reducidos, la secuenciación genómica que utilizase técnicas de fraccionamiento por tamaño requeriría 1.500.000 geles de fraccionamiento por tamaño (suponiendo una capacidad optimista de 2.000 pb por gel). Por estos motivos, los métodos de secuenciación que implican el fraccionamiento por tamaño no han sido adaptados para la secuenciación de genomas humanos.

Wiemarn et al., Analytical Biochemistry 234(2):166-174, 1996, páginas 166 a 174, describen una técnica "dúplex" de secuenciación del ADN que posibilita obtener simultáneamente dos secuencias independientes a partir de una reacción de secuenciación con la utilización de cebadores no marcados y el marcaje interno.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona un método de secuenciación de un ácido nucleico a partir de múltiples cebadores con una única etapa de hibridación de cebador. En este método, se hibridan dos o más cebadores de secuenciación al ADN molde que debe secuenciarse. El ADN molde puede ser de una cadena o de doble cadena desnaturalizado. A continuación, se bloquean todos los cebadores de secuenciación excepto uno. Se lleva a cabo nuevamente la secuenciación (por ejemplo la secuenciación a partir de pirofosfato) mediante elongación del cebador no bloqueado. Se deja que continúe la elongación hasta completarse (con polimerasa adicional y dNTPs, en caso necesario) o se termina (mediante polimerasa, ddNTPs y opcionalmente dNTPs); en cualquier caso impidiendo la elongación adicional del cebador no bloqueado. Se eliminan los reactivos de completado de cadena y/o de terminación. Seguidamente, se desbloquea uno de los cebadores bloqueados y se lleva a cabo la secuenciación pirofosfato mediante elongación del cebador nuevamente desbloqueado. Se continúa este procedimiento hasta desbloquear y secuenciar todos los cebadores de secuenciación. En una realización preferente, se utilizan dos cebadores (uno bloqueado y uno no bloqueado) para secuenciar ambos extremos de un ácido nucleico de doble cadena.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 ilustra un procedimiento ejemplar de secuenciación desde dos extremos;

Figura 2 ilustra los resultados de la demostración de la secuenciación desde los dos extremos en un aparato de pirosecuenciación de 454 Corp.;

Figura 3 ilustra los resultados del análisis de secuenciación desde los dos extremos, mostrando que se determina la secuencia de ambos extremos de un molde de ADN. SEC ID nº 6: atgcacatggttgacacagtggt; SEC ID nº 7: atgcacatggttgacacagtgg; SEC ID nº 8: atgccaccgacctagtctcaaactt;

Figura 4 ilustra una perla ejemplar de captura de ADN;

Figura 5 ilustra la encapsulación de una perla que comprende dos secuencias oligonucleótidas para la secuenciación de una doble cadena.

Figura 6 ilustra la PCR en fase solución y el procedimiento de direccionamiento a perla - una etapa en una realización preferente de la secuenciación desde dos extremos;

Figura 7 ilustra la rotura de emulsión y la recuperación de ADN molde amplificado en una perla - una etapa en una realización preferente de secuenciación desde dos extremos;

Figura 8 es una representación esquemática de un método preferente de secuenciación desde los dos extremos;

Figura 9 ilustra los resultados de la secuenciación de un genoma de Staphylococcus aureus;

Figura 10 ilustra las longitudes de lectura medias en un experimento que implicaba la secuenciación desde los dos extremos;

Figura 11 ilustra el número de pocillos...

1. Método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico, que comprende las etapas de:

(a) hibridar dos o más cebadores de secuenciación con una o una pluralidad de cadenas individuales de la molécula de ácido nucleico, en la que todos los cebadores excepto uno son cebadores reversiblemente bloqueados,

(b) incorporar por lo menos una base en la molécula de ácido nucleico mediante elongación de polimerasa a partir de un cebador no bloqueado,

(c) bloquear la elongación adicional de dicho cebador no bloqueado,

(d) desbloquear uno de los cebadores reversiblemente bloqueados, formando un cebador desbloqueado,

(e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que por lo menos uno de los cebadores reversiblemente bloqueados se haya desbloqueado y utilizado para determinar una secuencia mediante secuenciación pirofosfato.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha etapa (c) de bloquear la elongación adicional comprende:

(a) completar la elongación a partir del cebador no bloqueado con polimerasa y dNTPS, o

(b) terminar la elongación con polimerasa en un tampón que contiene manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o

(c) terminar la elongación químicamente.

3. Método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de eliminar dicha polimerasa, dNTPs y ddNTPs antes de dicha etapa (d).

4. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado se bloquea con un grupo químico seleccionado de entre el grupo que consiste de un grupo PO₄, un grupo tio y un grupo fosforotiol.

5. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado presenta un extremo 3' desapareado que puede desbloquearse mediante la puesta en contacto de dicho cebador con una exonucleasa.

6. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado presenta una o más bases no complementarias que forman un bucle y que no se hibridan con la molécula de ácido nucleico, en la que dicha base o bases no se encuentran en el extremo 5' ó 3' de dicho cebador reversiblemente bloqueado, y en el que dicho cebador reversiblemente bloqueado comprende un nucleótido dideoxi en su extremo 3'.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicho por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado resulta desbloqueado mediante digestión de endonucleasa de dicha base o bases no complementarias, formando una muesca en dicha base o bases no complementarias.

8. Método según la reivindicación 7, en el que la etapa (b) comprende la elongación por polimerasa en dicha muesca por parte de una polimerasa con capacidad de desplazamiento de cadena.

9. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado presenta una secuencia de 5'-NUX-3', en la que N representa una secuencia oligonucleótida de cualquier longitud, U es uracilo y X es un dideoxinucleótido.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicho cebador reversiblemente bloqueado resulta desbloqueado por la uracilo-ADN glucosilasa y AP endonucleasa, generando un cebador desbloqueado con un extremo 3' extensible.

11. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador reversiblemente bloqueado presenta una secuencia de 5'-NYZ-3', en la que N representa una secuencia oligonucleótida de cualquier longitud, Y es un nucleótido modificado, y Z representa una única base nucleótida, y en el que dicho nucleótido modificado puede ser desbloqueado por la formamidopirimidina (fapy)-ADN glucosilasa.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha base modificada se selecciona de entre el grupo que consiste de 8-oxoguanina, 8-oxoadenina, fapy-guanina, metil-fapy-guanina, fapy-adenina, aflatoxina-B₁-fapy-guanina, 5-hidroxicitosina y 5-hidroxiuracilo.

13. Método según la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico es un ADN genómico, ADNc o ADN episómico.

14. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador de secuenciación se hibrida con una cadena sentido del ácido nucleico y por lo menos un cebador de secuenciación se hibrida con una cadena antisentido de la molécula de ácido nucleico en la etapa (a).

15. Método según la reivindicación 1, en el que la elongación por polimerasa es de entre 1 y 250 bases.

16. Método según la reivindicación 1, en el que dicho método se lleva a cabo en un recipiente de reacción seleccionado de entre el grupo que consiste de una probeta, una cámara de reacción de una placa PicoTiter, una cámara de reacción de una matriz, y una cámara de reacción microencapsulada de una emulsión de agua en aceite.

17. Método según la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico presenta una longitud de entre 100 y 1.000 pb.

18. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos una de dichas cadenas de molécula de ácido nucleico o por lo menos uno de dichos cebadores se une a un soporte sólido.

19. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos una cadena de dicha molécula de ácido nucleico se une a un soporte sólido.

20. Método según la reivindicación 18, en el que por lo menos uno de dichos cebadores se inmoviliza en un soporte sólido para formar un cebador inmovilizado y una de dichas cadenas se une a un soporte sólido mediante hibridación con dicho cebador inmovilizado.

21. Método según la reivindicación 20, en el que el soporte sólido es un soporte sólido móvil esférico.

22. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos un cebador comprende un marcaje detectable.

23. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de desbloqueo comprende poner en contacto un cebador reversiblemente bloqueado con un agente para eliminar un grupo PO₄ de dicho cebador reversiblemente bloqueado.

24. Método según la reivindicación 23, en el que dicho agente se selecciona de entre el grupo que consiste de polinucleótido quinasa y fosfatasa alcalina.

25. Método según la reivindicación 1, en el que dicha polimerasa no presenta actividad exonucleasa 3' a 5'.

26. Método según la reivindicación 1, en el que dicho método determina una primera secuencia de ácido nucleico próxima a un extremo de dicha molécula de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico próxima a un segundo extremo de dicha molécula de ácido nucleico.

27. Método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende:

(a) hibridar un primer cebador de secuenciación no bloqueado con una primera cadena de la molécula de ácido nucleico,

(b) hibridar un segundo cebador de secuenciación bloqueado con una segunda cadena de la molécula de ácido nucleico,

(c) incorporar por lo menos una base en dicha primera cadena mediante extensión de dicho primer cebador no bloqueado con una polimerasa,

(d) bloquear la elongación adicional de dicho cebador no bloqueado,

(e) desbloquear el segundo cebador de secuenciación, y

(f) incorporar por lo menos una base en dicha segunda cadena mediante extensión de dicho segundo cebador con una polimerasa,

en donde las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en cualquier orden o simultáneamente.

28. Método según la reivindicación 27, en el que dicha etapa (d) de bloquear la elongación adicional comprende:

(a) completar la elongación a partir del cebador no bloqueado con polimerasa y dNTPS, o

(b) terminar la elongación con polimerasa en un tampón que contiene manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o

(c) terminar la elongación químicamente.

29. Método según la reivindicación 28, que comprende además la eliminación de dichos polimerasa, dNTPs y ddNTPs después de dicha etapa de bloqueo.

30. Método según la reivindicación 27, en el que dicho segundo cebador se bloquea con un grupo químico seleccionado de entre el grupo que consiste de un grupo PO₄, un grupo tio y un grupo fosforotiol.

31. Método según la reivindicación 27, en el que dicho método determina por lo menos una primera secuencia de ácido nucleico próxima a un primer extremo de dicha molécula de ácido nucleico y determina una segunda secuencia de ácido nucleico próxima a un segundo extremo de dicha molécula de ácido nucleico.

32. Método para determinar un haplotipo molecular de una muestra de ADN en múltiples locus, que comprende las etapas de:

(a) hibridar 2 ó más cebadores de secuenciación contiguos a una pluralidad de locus en una muestra de ADN, en la que todos los cebadores excepto uno son cebadores reversiblemente bloqueados y en la que cada locus contiene una secuencia de ácido nucleico que determina un haplotipo,

(b) determinar un haplotipo en un locus mediante elongación de polimerasa a partir de un cebador no bloqueado,

(c) bloquear la elongación adicional de dicho cebador no bloqueado,

(d) desbloquear uno de los cebadores reversiblemente bloqueados, formando un cebador desbloqueado,

(e) repetir las etapas (b) a (d) hasta que la totalidad de los cebadores reversiblemente bloqueados ha sido desbloqueada y utilizada para determinar un haplotipo molecular,

y en el que la secuenciación se lleva a cabo mediante secuenciación pirofosfato.

33. Método según la reivindicación 32, en el que dicha etapa (c) de bloquear la elongación adicional comprende:

(a) completar la elongación a partir del cebador no bloqueado con polimerasa y dNTPs, o

(b) terminar la elongación con polimerasa en un tampón que contiene manganeso, dNTPs y por lo menos un ddNTP, o

(c) terminar la elongación químicamente.

34. Método según la reivindicación 33, que comprende además la etapa de eliminar dichos polimerasa, dNTPs y ddNTPs después de dicha etapa de bloqueo.