REGIONES INMUNORREACTIVAS DE LA GLICOPROTEINA GPII DEL VIRUS DE LA VARICELA ZOSTER (VZV).

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE PEPTIDOS INMUNORREACTIVOS, LOS CUALES SON HOMOLOGOAS CON LA ZONA DE LAS POSICIONES 450 A 655 DE LOS AMINOACIDOS DE LA GLICOPROTEINA II DEL VIRUS ZOSTER DE LA VARICELA.

PREFERIBLEMENTE SON LOS PEPTIDOS, A LOS CUALES CORRESPONDEN LAS ZONAS DE LOS AMINOACIDOS 505 A 647, 517 A 597, 535 A 584 O 545 A 582. LOS PEPTIDOS INMUNORREACTIVOS SON UTILIZABLES EN EL PROCEDIMIENTO PARA LA DIAGNOSIS DE UNA INFECCION POR EL VIRUS ZOSTER DE LA VARICELA

Regiones inmunorreactivas de la glicoproteína gpII del virus de la Varicela-Zoster (VZV).

La presente invención se refiere a procedimientos inmunoquímicos para detectar anticuerpos contra el virus de la Varicela-Zoster (VZV) mediante el empleo de péptidos inmunorreactivos, que corresponden a la región de las posiciones de los aminoácidos 450 hasta 655 de la glicoproteína II del virus de la Varicela-Zoster. En este caso son preferentes aquellos procedimientos en los cuales la región indicada corresponda a los aminoácidos 505 hasta 647, 517 hasta 597 o 535 hasta 584. La presente invención se refiere así mismo a instrumental de ensayo que contiene péptidos inmunorreactivos, que corresponden a las regiones que han sido citadas precedentemente.

El VZV se asigna a la familia de los virus del Herpes de conformidad con la clasificación del Comité Internacional para la Virustaxonomía (ITCV). La infección primaria se produce en el 75% de los casos hasta la edad de 15 años y transcurre en la mayoría de los casos de manera inaparente. Por el contrario, en el caso de los adultos, que no hayan tenido todavía ningún contacto con el virus, y en el caso de personas, que presentan una inmunosupresión natural o terapéutica, la infección transcurre con una sintomatología severa. La infección del neonato conduce, de la misma manera, a una sintomatología severa puesto que el virus tiene acceso a través de la placenta y en este instante no existe ningún tipo de protección por medio de anticuerpos maternales. En conexión con la infección primaria el virus persiste durante toda la vida en los ganglios sensoriales. Tras la reactivación se expande el VZV a través de los nervios periféricos en los ganglios sensoriales y conduce como consecuencia al Herpes-Zoster.

A partir de la secuencia de nucleótidos completamente determinada del genoma VZV con una longitud de 124.884 bp (cepa Dumas; (A. J. Davison & J. E. Scott. (1986), J. Gen. Virol. 67, 1759-1816)) pueden deducirse 70 marcos de lectura abiertos, entre los cuales se encuentran también los marcos de lectura abiertos de las glicoproteínas conocidas actualmente gpI (ORF 68), gpII (ORF 31), gpIII (ORF 37), gpIV (ORF 67), gpV(ORF 14) y gpVI (ORF 60). La secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de nucleótidos muestra homologías marcadas respectivamente de forma variable para las glicoproteínas gE, gB, gH, gI, gC y gL del virus del Herpes Simplex (HSV). Sin embargo, no existe ningún punto de referencia relativo a que pueda derivarse de la homología de la secuencia también una homología de la función. Los marcos de lectura abiertos de las glicoproteínas gpI, gpII, gpIII y gpV han podido ser confirmados por medio de la biología molecular. En contra de lo que ocurre en el caso de la glicoproteína gB del HSV, que ha sido investigada detalladamente, existen menos datos sobre la proteína homóloga de VZV, gpII. Las investigaciones correspondientes se limitan a la biosíntesis de la gpII y al significado de la gpII para el proceso de la neutralización de los virus (P. M. Keller et al. (1986), Virologie 152, 181-191; M. Massaer et al. (1993), J. Gen. Virol. 74, 491-494).

Los autores Ellis et al. (E.P. 0210931B1) han confirmado el ORF 31 de la gpII. Por otra parte, los autores Ellis et al., han descrito la purificación de la gpII a partir de células MRC-5 infectadas con VZV (fibroblastos humanos) y su empleo para la obtención de anticuerpos neutralizantes de los virus a partir de conejillos de Indias. Las publicaciones de los autores P. M. Keller et al. (1986), Virologie 152, 181-191 y M. Massaer et al. (1993), J. Gen. Virol. 74, 491-494 emplean, entre otras cosas, la gpII, que ha sido purificada por medio de una cromatografía de afinidad a partir de células infectadas con VZV, para llevar a cabo la determinación del título de anticuerpo específico para el VZV de sueros humanos. La publicación del autor A. Bollen (E.P 0405867 A1; US 371772) expresa, tras la deleción de la región carboxiterminal, gpII sin anclaje con la membrana, con ayuda del sistema de expresión del baculovirus en células SF9 y por medio de la expresión constituyente en células CHO para la obtención de una vacuna contra el VZV. Por otra parte, la publicación de los autores E. H. Wasmuth & W. J: Miller ((1990), J. Med. Virol. 32, 189-193) muestra, mediante el empleo de glicoproteínas (incluso la gpII) en el ensayo de glicoproteína-ELISA o en el ensayo Dot-ELISA, purificadas por afinidad, procedentes de células infectadas con VZV, la sensibilidad de estos métodos de ensayo y la relación entre el título de anticuerpo determinado y la protección contra una infección producida por el VZV. Sin embargo, ninguna de las publicaciones que han sido citadas precedentemente permite obtener una conclusión sobre la obtención de cantidades suficientes de la glicoproteína gpII para el establecimiento de un ensayo a escala relevante desde el punto de vista del diagnóstico.

Se ha presentado una investigación de regiones cuestionablemente inmunorreactivas de la glicoproteína gpII en la publicación de los autores Kjartansdottir et al. (1996), Arch. Virol., tomo 141, Nr. 12, 2465-2469. Como resultado de esta investigación no pudo especificarse por parte de los autores de la publicación ninguna otra región inmunorreactiva, con excepción de una sola región (AS 417-447).

Los métodos serológicos para la verificación de la situación de inmunidad específica para el VZV son muy numerosos y van desde el ensayo inmunorradiológico Radio- immuno- assay (RIA), pasando por el ensayo inmunoabsorbente ligado a un enzima Enzyme- linked- immunosorbentassay (ELISA), por un ensayo de fluorescencia de anticuerpos a antígenos de membrana Fluoreszent- antibody- membran- antigen- assay (FAMA), por el ensayo de inmunofluorescencia Immun-Fluoreszenz- Test (IFT) hasta la fijación del complemento Komplement- Fixation (CF). En este caso, se detectan preponderantemente anticuerpos específicos del VZV. Como antígeno se utiliza, con frecuencia, material vírico, que ha sido obtenido sobre cultivos de fibroblastos humanos, siguiéndose un cultivo engorroso, y que ha sido preparado siguiéndose métodos especiales para el empleo en diagnóstico.

Sin embargo, la obtención de los antígenos para el VZV a partir de fibroblastos infectados va acompañada de un peligro de infección para el personal dedicado a esta finalidad. Por otra parte, la obtención requiere una gran inversión de costes y de tiempo entre otras cosas debido a que el virus no es liberado por las células infectadas y que, como consecuencia, se requieren procedimientos de purificación especiales. Para el empleo del antígeno sin purificación previa para un ensayo inmunoquímico se someten a una digestión las células infectadas con el VZV mediante tratamiento con ultrasonidos y el antígeno se emplea directamente tras la dilución para el recubrimiento de, por ejemplo, placas de microtitulación. Puesto que en el caso de este método se enlazan sobre las cavidades de las placas de microtitulación, además de los antígenos específicos de virus, preponderantemente también antígenos específicos de la célula, los antígenos específicos de la célula, especialmente cuando estén presentes determinadas enfermedades, por ejemplo enfermedades autoinmunes, pueden conducir a resultados positivos faltos y, como consecuencia, a un diagnóstico erróneo. Otros procedimientos de ensayo, que están basados en la glicoproteína vírica purificada, tal como por ejemplo un ensayo de glicoproteína-ELISA, requieren procedimientos de purificación extraordinariamente engorrosos y sometidos a grandes pérdidas de tal manera, que el establecimiento de ensayos de diagnóstico inmunoquímicos a gran escala apenas puede ser realizado hasta el presente. Como consecuencia de la homología marcada entre las glicoproteínas de los virus del Herpes a se observan frecuentemente también para el ensayo de glicoproteína-ELISA reactividades cruzadas con anticuerpos específicos del HSV y condicionado a esto, resultados positivos falsos.

Una posible solución del problema, que ha sido indicado precedentemente, reside en el empleo de proteínas recombinantes, que pueden ser preparadas en grandes cantidades en sistemas heterólogos, por ejemplo en Escherischia coli (E. coli). En este sistema queda excluida una posible infección del personal por VZV. Por otra parte está dada la posibilidad de un diagnóstico diferencial dirigido a una proteína vírica específica. De manera especial, la región reactiva de la proteína VZV puede ser limitada de tal manera que casi pueden excluirse o pueden excluirse por completo las reactividades cruzadas...

1. Procedimiento inmunoquímico para la detección de anticuerpos contra el virus de Varicela-Zoster (VZV) en una muestra por medio de un péptido inmunorreactivo, que corresponde a la región de aminoácidos desde 450 hasta 655 de la gpII del VZV.

2. Procedimiento inmunoquímico según la reivindicación 1, en el que el péptido inmunorreactivo corresponde a la región de aminoácidos desde 505 hasta 647 de la gpII del VZV.

3. Procedimiento inmunoquímico según la reivindicación 2, en el que el péptido inmunorreactivo corresponde a la región de aminoácidos desde 517 hasta 597 de la gpII del VZV.

4. Procedimiento inmunoquímico según la reivindicación 3, en el que el péptido inmunorreactivo corresponde a la región de aminoácidos desde 535 hasta 584 de la gpII del VZV.

5. Péptido inmunorreactivo, que corresponde a la región de aminoácidos desde 535 hasta 584 de la gpII del VZV.

6. Instrumentación de ensayo para llevar a cabo la detección de anticuerpos contra el VZV, que contiene un péptido inmunorreactivo, que corresponde a una región de la gpII del VZV, elegida entre las regiones siguientes: aminoácido 450 hasta 655, aminoácido 505 hasta 647, aminoácido 517 hasta 597 y aminoácido 535 hasta 584.