PROCEDIMIENTO DIAGNOSTICO PARA EL RECONOCIMIENTO DE PORTADORES DE LA VARIANTE MARBURG I DE LA PROTEASA QUE ACTIVA EL FACTOR VII (FSAP) CON AYUDA DE LA MODULACION DIFERENCIAL DE LA ACTIVIDAD DE FSAP.
Procedimiento de diagnóstico para la detección de personas que tienen una expresión heterocigota u homocigota genéticamente condicionada de la variante MR I de la proteasa que activa el factor VII (FSAP),
en el que se determina la actividad del FSAP, caracterizado porque se determina la actividad del FSAP que se halla contenido en una muestra, en ausencia y también en presencia de un modulador diferencial de la actividad, en el que el modulador diferencial de la actividad cambia la actividad del FSAP en muestras de personas que tienen una expresión heterocigota u homocigota genéticamente condicionada de la variante MR I del FSAP en una amplitud que es distinta de la amplitud en las muestras de personas que no expresan la variante MRI del FSAP
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E06024985.
Solicitante: DADE BEHRING MARBURG GMBH.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: EMIL-VON-BEHRING-STRASSE 76,35041 MARBURG.
Inventor/es: SCHWARZ, HERBERT, VITZTHUM,FRANK,DR.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 4 de Diciembre de 2006.
Fecha Concesión Europea: 21 de Octubre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/37 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › peptidasa o proteinasa.
- C12Q1/56 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen factores de coagulación de la sangre, p. ej. trombina, tromboplastina, fibrinógeno.
- G01N33/68V
- G01N33/86 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que interviene el tiempo de coagulación de la sangre.
Clasificación PCT:
- C12Q1/37 C12Q 1/00 […] › peptidasa o proteinasa.
- G01N33/573 G01N 33/00 […] › para enzimas o isoenzimas.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
![PROCEDIMIENTO DIAGNOSTICO PARA EL RECONOCIMIENTO DE PORTADORES DE LA VARIANTE MARBURG I DE LA PROTEASA QUE ACTIVA EL FACTOR VII (FSAP) CON AYUDA DE LA MODULACION DIFERENCIAL DE LA ACTIVIDAD DE FSAP.](https://patentados.com/img/2010/02/procedimiento-diagnostico-reconocimiento-portadores-variante-marburg-i.jpg)
Fragmento de la descripción:
Procedimiento diagnóstico para el reconocimiento de portadores de la variante Marburg I de la proteasa que activa el factor VII (FSAP) con ayuda de la modulación diferencial de la actividad de FSAP.
La invención forma parte del campo del diagnóstico de la Mutación Marburg I (MR I) de la proteasa que activa el factor de coagulación VII de la sangre (FSAP), que se encuentra en aproximadamente 5 a 10% de la población de Europa Occidental. De acuerdo con un estudio de Willeit y Otro(s), los portadores heterocigotos de la mutación FASP MR I presentan en comparación con el promedio de la población, un mayor riesgo de desarrollar una estenosis de la carótida (Carotis Stenose) [Willeit y Otro(s) (2003): Marburg I polymorphism of factor VII activating protease: a prominent risk predictor of carotid stenosis. Circulation 107, 667-670]. Dado que la presencia de una mutación FASP MR I representa un marcador potencial de una predisposición genética para el desarrollo de enfermedades ateroscleróticas, la detección fiable de portadores homo o heterocigotos de la mutación FASP MR I es de interés, en especial en vista a un tratamiento médico preventivo individual.
El FSAP es una serin proteasa plasmática, que también se ha descrito bajo el nombre PHBSP (serin proteasa que liga el hialuronan del plasma). El FSAP se encuentra presente en el plasma humano en una concentración de aproximadamente 12 µg/ml, y por medio de autocatálisis de la proenzima de una sola cadena (sc-FSAP, single chain-FSAP) puede transformarse en la proteasa de dos cadenas, activa (tc-FSAP, two chain-FSAP). La proteasa activa dispone de diversas funciones o actividades. Se sabe que el FSAP tiene por una parte la capacidad de activar el Factor de Coagulación Sanguínea VII así de activar los activadores del plasminógeno, de una sola cadena, como las prouroquinasas que activan plasminógenos, como el scuPA (single chain urokinase plasminogen activator) y el sctPA (single chain tissue plasminogen activator). Por otra parte, el FSAP dispone de la capacidad de inactivar los factores de coagulación sanguínea V/Va y VIII/VIIIa).
En el documento EP 952 215 A2 se describen diversos procedimientos de ensayo para la determinación cualitativa o cuantitativa del FSAP, que aprovechan estas actividades biológicas del FSAP. Otra actividad del FSAP, que permite una determinación de la proteasa activa y que también se ha descrito en el documento patente anteriormente mencionado, así como en Römish y Otro(s): The FVII activating protease cleaves single-chain plasminógeno activators. Haemostasis 29, 292-299 y en Hungfeld y Otro(s). (1999): Detection of a novel plasma serine protease during purification of vitamin K-dependent coagulation factors. FEBS Letters 456, 290-294, es la actividad amidolítica del FSAP con respecto a los substratos de bajo peso molecular, en especial frente al substrato de cromógeno S-2288TM (HD-Ile-Pro-Arg-pNA).
Además de la secuencia de tipo salvaje del gen humano de FSAP se conocen diversos polimorfismos de nucleótidos, que en dos casos también conducen a un cambio en la secuencia de aminoácidos (EP 1 182 258 A1). La denominada mutación Marburg I (también denominada polimorfismo, alelo o variante Marburg I) conduce a un intercambio de aminoácidos Gly/Glu en la posición 534 de la proenzima, péptido de señal (Gly/Gu 534) inclusive, y tiene como resultado una disminución del 50 - 80% de la actividad que activa la prouroquinasa, mientras que la capacidad de activar el Factor VII se conserva sin modificaciones. Otra mutación, la denominada mutación Marburg II (MR II) (también denominada polimorfismo, alelo o variante MR II) conduce a un intercambio de aminoácidos Glu/Gln en la posición 370 de la proenzima, péptido señal (Glu/Gln 370) inclusive. Sin embargo, la Mutación Marburg II no tiene ninguna influencia sobre la actividad del FSAP como activador de la prouroquinasa.
En el estado de la técnica, la detección individual de personas portadoras de por lo menos una copia de la variante FASP MR I, es posible mediante dos enfoques metódicos diferentes. Hasta la actualidad, una detección segura del intercambio de aminoácidos Gly/Glu en la posición 534 de la proenzima (Gly/Glu 534) sólo es posible mediante la secuenciación de la correspondiente región codificadora en el ADN genómico o en el ARNm. Un intercambio de bases G/A en la secuencia genómica, que puede detectarse en la posición de nucleótidos 1601 del ADNc, constituye el causante genético del mutante FSAP MR I (EP 1 182 258 A1). Si bien el análisis de las secuencias de ADN provee resultados fiables, desde el punto de vista de los análisis de laboratorio rutinarios, existe una necesidad de procedimientos de ensayo que sean lo más económicos, rápidos y seguros posible, y que además puedan implementarse automáticamente en los equipos de diagnóstico disponibles. Se prefieren predominantemente procedimientos inmunoquímicos para la detección o para los ensayos, por cuanto cumplen con los criterios mencionados y ya han encontrado una amplia utilización en los diagnósticos basados en análisis de laboratorio.
Otro método para la determinación de un mutante FASP MR I se basa en la determinación del potencial del FSAP presente en una muestra para activar la prouroquinasa. A tal efecto se acopla a una fase sólida un anticuerpo específico que no está en condiciones de diferenciar entre FSAP de tipo salvaje y las variantes de FSAP conocidas, y se lo somete a incubación junto con el líquido de la muestra. Después del añadido de prouroquinasa como substrato de FSAP y de un substrato de uroquinasa cromógeno, se determina la cantidad de cromógeno hecha reaccionar como medida de la actividad del FSAP como activador de la prouroquinasa. Los portadores de la mutación Marburg I muestran una actividad para activar la prouroquinasa, disminuida en un 50 - 80%. Sin embargo, una menor actividad para activar la prouroquinasa también puede estar condicionada (impuesta) por una pequeña concentración de FSAP en la muestra. Por ello, hasta la actualidad es necesario determinar no solamente la actividad para activar la prouroquinasa, sino adicionalmente también la concentración de antígeno de FSAP en una muestra (EP 1 348 761 A1 o US 2002/0142316 A1). En el estado de la técnica se conocen anticuerpos monoclonales, que permiten la detección inmunológica del FSAP. En el documento EP 1 182 258 se describen dos anticuerpos monoclonales, que provienen de células hibridoma DSM ACC2453 o DSM ACC2454, que se habían obtenido después de la inmunización de ratones con proteína del FSAP. Ambos anticuerpos ligan no solamente proteína del FSAP de tipo salvaje, sino también las variantes Marburg I y Marburg II. Otros anticuerpos del FSAP conocidos se ligan de igual manera al FSAP de tipo salvaje así como a las variantes mutantes conocidas; de manera que, por ejemplo, en un ELISA Sandwich se determina el contenido total de antígeno de FSAP en una muestra (véase también el documento DE 100 23 923 A1). Por ello el estado de la técnica enseña que sólo si se comprueba una menor actividad para activar la prouroquinasa, junto con una concentración de antígeno de FSAP en el intervalo normal, esto es una indicación concreta de la presencia de una variante FSAP MRI.
La presente invención tuvo como cometido poner a disposición otros procedimientos para el diagnostico fiable de una mutación MR I o para la detección individual de portadores heterocigotos u homocigotos de una mutación MR I, que permitan prescindir de una determinación del antígeno de FSAP.
Este cometido se logra poniendo a disposición el procedimiento conforme a la invención, descrito en las reivindicaciones, que permiten diferenciar de manera fiable los portadores heterocigotos u homocigotos de un polimorfismo MR I, de los que no son portadores. La ventaja del presente procedimiento, que aprovecha la modulación diferencial de la actividad de la variante FASP MR I, consiste en una discriminación fiable entre portadores y no portadores de la mutación FASP MR I, y en especial en que puede prescindirse de una determinación adicional del contenido de antígeno en una muestra.
Se ha descubierto que mediante la utilización de moduladores adecuados de la actividad, los denominados moduladores diferenciales de la actividad, la actividad del FSAP, en especial la actividad amidolítica del FSAP en comparación con substratos péptidos de bajo peso molecular, así como la actividad del FSAP para activar el activador del activador del plasminógeno, en muestras de no portadores de un polimorfismo MR I, se modula de manera diferente que la actividad del FSAP en muestras de portadores heterocigotos u homocigotos de un polimorfismo...
Reivindicaciones:
1. Procedimiento de diagnóstico para la detección de personas que tienen una expresión heterocigota u homocigota genéticamente condicionada de la variante MR I de la proteasa que activa el factor VII (FSAP), en el que se determina la actividad del FSAP, caracterizado porque se determina la actividad del FSAP que se halla contenido en una muestra, en ausencia y también en presencia de un modulador diferencial de la actividad, en el que el modulador diferencial de la actividad cambia la actividad del FSAP en muestras de personas que tienen una expresión heterocigota u homocigota genéticamente condicionada de la variante MR I del FSAP en una amplitud que es distinta de la amplitud en las muestras de personas que no expresan la variante MRI del FSAP.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que la actividad del FSAP que se determina, es la actividad del FSAP que activa el activador del plasminógeno.
3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que la actividad del FSAP que se determina es la actividad amidolítica del FSAP.
4. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el modulador diferencial de la actividad inhibe o activa la actividad del FSAP en muestras de personas que no expresan la variante MR I del FSAP, en una amplitud mayor que en muestras de personas que tienen una expresión heterocigota u homocigota genéticamente condicionada de la variante MR I del FSAP.
5. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones precedentes, en el que como modulador diferencial de la actividad se utiliza aprotinina.
6. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones precedentes, en el que como modulador diferencial de la actividad se utiliza un anticuerpo anti-FSAP monoclonal o policlonal.
7. Procedimiento conforme a la reivindicación 6, en el que se utiliza un anticuerpo anti-FSAP monoclonal producido por la cepa de células hibridoma DSM ACC2726.
8. Procedimiento conforme a la reivindicación 6, en el que se utiliza un anticuerpo anti-FSAP monoclonal que se liga a un epítope de FSAP que se liga por un anticuerpo anti-FSAP monoclonal producido por la cepa de células hibridoma DSM ACC 2726.
9. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la amplitud del cambio en la actividad del FSAP se determina como sigue:
a).- determinación de la actividad del FSAP en una primera alícuota de una muestra en presencia del modulador diferencial de la actividad;
b).- determinación de la actividad del FSAP en una segunda alícuota de la misma muestra en ausencia del modulador diferencial de la actividad; y
c).- comparación de ambas actividades determinadas en a) y b).
10. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la amplitud del cambio en la actividad del FSAP se determina como sigue:
a).- determinación de la actividad del FSAP en una alícuota de una muestra en presencia del modulador diferencial de la actividad; seguida por:
b).- adición del modulador diferencial de la actividad al preparado reactivo; y
c).- determinación de la actividad del FSAP en presencia del modulador diferencial de la actividad; y
d).- comparación de ambas actividades determinadas en a) y c).
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