REACTIVOS Y UN METODO PARA EL MARCAJE POR SATURACION DE PROTEINAS.

Un conjunto concordante de colorantes fluorescentes que comprende al menos dos colorantes fluorescentes diferentes de fórmula (I):

Reactivos y un método para el marcaje por saturación de proteínas.

La presente invención se refiere a colorantes fluorescentes y a un método para marcar muestras de proteínas complejas para permitir el análisis diferencial de proteínas.

La Electroforesis Diferencial en Gel 2D (bidimensional) (Difference Gel Electrophoresis: DIGE) usa colorantes fluorescentes concordantes, resueltos espectralmente, para marcar muestras de proteína antes de la separación electroforética bidimensional (2D) (Minden, J. et al, Electrophoresis, (1997), 18, 2071). Este método multiplexor fluorescente supera muchos de los inconvenientes de la electroforesis 2D tradicional. El premarcaje fluorescente de muestras de proteína permite que muestras múltiples sean analizadas sobre el mismo gel, lo que hace que se identifiquen fácilmente diferencias cuantitativas entre las muestras por superposición de las imágenes fluorescentes. Para permitir la multiplexación fluorescente, las muestras de proteína han de ser marcadas por igual con los colorantes, y la migración de las proteínas marcadas en el gel ha de ser concordante posicionalmente, para que sea posible detectar diferencias cuantitativas.

El documento WO 96/33406 (Minden, J. et al) describe un método para detectar diferencias entre distintas muestras de células usando colorantes concordantes, resueltos espectralmente, para marcar proteínas en las muestras antes de la electroforesis 2D. Se describen colorantes que son concordantes para el peso molecular y la carga para dar una migración equivalente. El método emplea colorantes de cianina que tienen un grupo reactivo éster de N-hidroxisucinimidilo (NHS) para marcar aminas. El grupo éster de NHS está diseccionado en el varepsilon-amino de los restos de lisina en las proteínas y tiene por resultado el marcaje covalente. Tres colorantes diferentes (Cy2^TM, Cy3 y Cy5) son derivatizados para permitir la multiplexación. Estas moléculas de colorante tienen un peso molecular de aproximadamente 500 Daltons y son concordantes en masa para dar la migración equivalente de la proteína marcada. Los colorantes cuentan con la carga intrínseca del flúor de la cianina para compensar la pérdida de una carga positiva de la lisina en la conjugación del colorante con la lisina. El documento WO 96/33406 describe el uso de estos colorantes en una estrategia mínima de marcaje para marcar entre 1 y 2% de los sitios de unión disponibles. Para conseguir una migración equivalente, las parejas de colorante eran concordantes por su masa compensando la diferencia de la longitud del enlazador entre los anillos de indol de la cianina por modulación del tamaño de la cadena alifática unida a un nitrógeno del indol por dos unidades de carbono. Dos o más colorantes resueltos espectralmente que cumplen estos criterios representan un conjunto de colorantes de marcaje mínimo concordantes. La migración equivalente del conjunto de colorantes concordante de marcaje mínimo de lisina fue demostrada usando propil Cy3 y metil Cy5 para marcar proteínas, seguido por su separación en 2D superponiendo las imágenes resultantes para mostrar la concordancia posicional de las dos muestras marcadas.

La publicación de Ernst L. A. et al., Cyanine dye labeling reagents for sulphydryl groups cytometry, Alan Liss, Nueva York, EE.UU., vol. 10, nº 1, 1989, páginas 3-10, XP000071370 ISSN: 0196-4743, describe reactivos que comprenden colorantes fluorescentes de merocianina y cianina, para el marcaje covalente de proteínas y otras biomoléculas. Los colorantes se describen como poseedores de unas propiedades ventajosas para la citoquímica. Los colorantes usados en este artículo no son concordantes entre sí con respecto a la estructura molecular y a la carga.

Los restos de lisina son muy abundantes en las proteínas, asegurando que esta estrategia de marcaje representará a todas la proteínas presentes en una muestra compleja. Sin embargo, el contenido de lisina típico de una proteína es 7% y, si cada lisina de una proteína fuese marcada, esto tendría por resultado un gran desplazamiento de la masa debido al colorante. Así, la estrategia empleada es marcar "mínimamente" la proteína para asegurar que solamente son marcadas de aproximadamente 1 a 5 moléculas de proteína, dando así una probabilidad estadística de que cada molécula marcada tiene solamente un colorante unido. Esto crea un patrón de manchas en 2D que es muy similar a las imágenes teñidas con plata, pero que da una mayor sensibilidad y margen dinámico, y la facultad de multi- plexar.

Un análisis en gel en 2D típico implica "picar" manchas de la proteína de interés a partir del gel para su identificación por MALDI-MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Mass Spectrometry). El método de marcaje mínimo tiene por resultado 2 manchas por proteína (es decir, marcada y no marcada), con la mayor parte de la proteína en la mancha no marcada. La mancha no marcada ha de estar situada para recuperar proteína suficiente para permitir la identificación por MALDI-MS. Esto requiere una etapa de tinción adicional antes de picar la mancha. Con el fin de facilitar el picado de la mancha de proteína directamente a partir de geles fluorescentes, se requiere una estrategia de marcaje que dé una sola mancha por proteína.

La estrategia de marcaje empleada en la presente invención procura saturar la proteína con colorante con el fin de marcar el mayor número posible de restos diana y producir una sola mancha marcada por isoforma de proteína. Así, una molécula de colorante de cianina es acoplada a todos los restos diana de aminoácido disponible en una proteína, dando así una población única de moléculas de proteína marcadas, con un número similar de moléculas de colorante unidas. De acuerdo con la presente invención, el marcaje de saturación se consigue usando conjuntos de colorantes direccionados en los restos de cisteína, que contienen un grupo tiol. Los restos de cisteína están presentes en el 95% de la proteínas, pero en cada proteína hay menos restos de cisteína que de lisina. Esto quiere decir que pueden ser marcadas todas las moléculas de proteína, pero cada molécula de proteína tendrá menos restos marcados que si los restos de lisina fuesen marcados a saturación. Esto tiene por resultado el aumento de la sensibilidad de detección ya que la proporción de proteína marcada es más alta que con el marcaje mínimo, pero asegura que las proteínas siguen siendo solubles.

El aumento de la masa debido a la adición de colorante (el desplazamiento de masa) con el marcaje de saturación de los restos de cisteína será mayor que el aumento empleando una estrategia de marcaje mínimo de los restos de lisina. Sin embargo, el aumento de la masa es menor que el que se observaría si se emplease un método de marcaje de saturación sobre restos de lisina. La cuantía del desplazamiento de masa debido a la adición de colorante variará para cada proteína dependiendo del contenido de cisteína en la proteína individual (típicamente aproximadamente 2%) y la disponibilidad de los restos de cisteína para el colorante bajo las condiciones de marcaje. Esto tiene por resultado un patrón 2D de manchas que es muy diferente de los mapas de proteína 2D teñidos con plata publicados.

La presente invención por consiguiente proporciona reactivos fluorescentes y un método para el marcaje reproducible de todos los restos de cisteína disponibles que son accesibles en una mezcla de proteínas que contienen cisteína. Los derivados de colorante de cianina de acuerdo con la presente invención proporcionan valiosos conjuntos de marcadores fluorescentes, cada uno de los cuales tiene una estructura de núcleo común, y que son particularmente útiles para análisis multiplexión.

En consecuencia, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un conjunto concordante de colorantes fluorescentes que comprende al menos dos colorantes fluorescentes diferentes que tienen la fórmula (I):

en la que n es diferente para cada uno de dichos colorantes y es 1, 2 ó 3;

Z¹ y Z² representan independientemente los átomos de carbono necesarios para completar un sistema de anillo fenilo o naftilo;

uno de los grupos R¹ y R² es el grupo:

en el que Y es un grupo de unión diana;

el grupo restante R¹...

1. Un conjunto concordante de colorantes fluorescentes que comprende al menos dos colorantes fluorescentes diferentes de fórmula (I):

en la que n es diferente para cada uno de dichos colorantes y es 1, 2 ó 3;

Z¹ y Z² representan independientemente los átomos de carbono necesarios para completar un sistema de anillo fenilo o naftilo;

uno de los grupos R¹ y R² es el grupo:

en el que Y es un grupo de unión diana;

el grupo restante R¹ o R² se elige entre los grupos -(CH₂)₄-W o -(CH₂)_r-H;

el grupo R³ es hidrógeno, excepto cuando o bien R¹ o bien R² es -(CH₂)_r-H, en cuyo caso R³ es W; W se elige entre ácido sulfónico y sulfonato;

p es un número entero de 3 a 6;

q se elige para que sea 2 ó 3; y

r es un número entero de 1 a 5;

y sus sales;

caracterizado porque cuando n de dos de dichos colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de dichos dos colorantes difiere en -1.

2. Un conjunto concordante de colorantes fluorescentes de acuerdo con la reivindicación 1ª, que comprende al menos dos diferentes colorantes fluorescentes de fórmula (II):

en la que n es diferente para cada uno de dichos colorantes y es 1, 2 ó 3;

uno de los grupos R¹ y R² es el grupo:

en el que Y es un grupo de unión diana;

el grupo restante R¹ o R² se elige entre -(CH₂)₄-W o -(CH₂)_r-H;

el grupo R³ es hidrógeno, excepto cuando o bien R¹ o bien R² es -(CH₂)_r-H, en cuyo caso R³ es W; W se elige entre ácido sulfónico y sulfonato;

p es un número entero entre 3 y 6;

q se elige para que sea 2 ó 3;

y r es un número entero de 1 a 5;

y sus sales;

caracterizado porque cuando n de dos de dichos colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de dichos dos colorantes difiere en -1.

3. Un conjunto concordante según las reivindicaciones 1ª o 2ª, que comprende al menos dos colorantes fluorescentes diferentes de acuerdo con la fórmula (I) o (II) en la cual:

n se elige para que sea 1 ó 2;

p se elige para que sea 4 ó 5;

q se elige para que sea 2 ó 3; y

r se elige para que sea 1, 2 ó 3.

4. Un conjunto concordante según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª, en el que dicho grupo de unión diana Y en cada colorante del conjunto de colorantes es el mismo, y se elige entre un grupo maleimido y un grupo yodoacetamido.

5. Un conjunto concordante según la reivindicación 4ª, en el que dicho colorante Y es un grupo maleimido.

6. Un conjunto concordante según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 5ª, en el que dichas sales se eligen entre K⁺, Na⁺, NH₄⁺, R₃NH⁺ y R₄N⁺ en donde R es alquilo C₁ a C₄.

7. Un conjunto concordante según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 6ª, elegidos entre:

Conjunto 1

1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1-etil-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)-prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio (Compuesto I); y

1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(1,3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio (Compuesto II);

Conjunto 2

1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1-propil-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio (Compuesto III); y

1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(1-etil-3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio (Compuesto IV);

Conjunto 3

1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1-etil-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio (Compuesto I); y

1-(5-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxopentil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(1-etil-3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio (Compuesto V);

Conjunto 4

1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(3,3-dimetil(1-sulfo-butil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio (Compuesto VI); y

1-(5-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxopentil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(3,3-dimetil-(1-sulfo-butil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio (Compuesto VII).

Conjunto 5

1-(6-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(1-etil-3,3-dimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio (Compuesto VIII); y

1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(1-etil-3,3-trimetil-5-sulfo-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio (Compuesto IV); y

Conjunto 6

1-(6-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propil]amino}-6-oxohexil)-2-[(1E,3E)-3-(3,3-dimetil(1-sulfo-butil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)-prop-1-enil]-3,3-dimetil-3H-indolio (Compuesto IX); y

1-(6-{[2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etil]amino}-6-oxohexil)-3,3-dimetil-2-[(1E,3E,5E)-5-(3,3-dimetil-(1-sulfo-butil)-1,3-dihidro-2H-indol-2-iliden)penta-1,3-dienil]-3H-indolio (Compuesto X).

8. Un método para marcar una mezcla de proteínas de una muestra en la que cada una de dichas proteínas contiene uno o más restos de cisteína, comprendiendo dicho método:

i) añadir a un líquido acuoso que contiene dicha muestra un colorante fluorescente elegido entre un conjunto concordante de colorantes fluorescentes según las reivindicaciones 1ª o 2ª, en donde dicho colorante contiene un grupo de unión diana que es reactivo de forma covalente con dichos uno o más restos de cisteína de dichas proteínas; y

ii) hacer reaccionar dicho colorante con dichas proteínas de forma que dicho colorante marque dichas proteínas;

con lo que todos los restos de cisteína disponibles en dichas proteínas son marcados con dicho colorante.

9. Un método según la reivindicación 8ª, en el que dicho grupo de unión diana se elige entre un grupo maleimido y un grupo yodoacetamido.

10. Un método según la reivindicación 8ª, que comprende además, antes de la etapa i), la etapa de tratar la proteína con un reductor.

11. Un método según la reivindicación 8ª, en el que dicho colorante se usa en un intervalo de 5 a 200 nmoles de colorante por 50 µg de proteína.

12. Un método según la reivindicación 8ª, en el que dicho marcaje se lleva a cabo a un pH en el intervalo de 6,0 a 9,0.

13. Un método para marcar una o más proteínas de una muestra, comprendiendo el método:

i) añadir a una muestra líquida que contiene dichas una o más proteínas un colorante fluorescente elegido entre un conjunto concordante de colorantes fluorescentes, teniendo cada colorante de dicho conjunto la fórmula (I):

en la que n es diferente para cada colorante y es 1, 2 ó 3;

Z¹ y Z² representan independientemente los átomos de carbono necesarios para completar un sistema de anillo fenilo o naftilo;

uno de los grupos R¹ y R² es el grupo:

en el que Y es un grupo de unión diana;

el grupo restante R¹ o R² se elige entre los grupos -(CH₂)₄-W ó -(CH₂)_r-H;

el grupo R³ es hidrógeno, excepto cuando o bien R¹ o bien R² es -(CH₂)_r-H, en cuyo caso R³ es W; W se elige entre ácido sulfónico y sulfonato;

p es un número entero de 3 a 6;

q se elige para que sea 2 ó 3; y

r es un número entero de 1 a 5;

y sus sales;

caracterizado porque cuando n de dos de dichos colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de dichos dos colorantes difiere en -1; y

ii) incubar dicho colorante con dicha muestra bajo condiciones adecuadas para marcar dichas una o más proteínas.

14. Un método según la reivindicación 13ª, en el que cada uno de los grupos Z¹ y Z² representa los átomos de carbono necesarios para completar un sistema de anillo de fenilo.

15. Un método según la reivindicación 13ª o la reivindicación 14ª, en el que

n se elige para que sea 1 ó 2;

p se elige para que sea 4 ó 5;

q se elige para que sea 2 ó 3; y

r se elige para que sea 1, 2 ó 3.

16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 13ª a 15ª, en el que el grupo de unión Y se elige entre un grupo maleimido y un grupo yodoacetamido.

17. Un kit que comprende un conjunto concordante de colorantes fluorescentes que comprende al menos dos colorantes fluorescentes diferentes que tiene la fórmula (I):

en la que n es diferente para cada uno de dichos colorantes y es 1, 2 ó 3;

Z¹ y Z² representan independientemente los átomos de carbono necesarios para completar un sistema de anillo fenilo o naftilo;

uno de los grupos R¹ y R² es el grupo:

en el que Y es un grupo de unión diana;

el grupo restante R¹ o R² se elige entre los grupos -(CH₂)₄-W ó -(CH₂)_r-H;

el grupo R³ es hidrógeno, excepto cuando o bien R¹ o bien R² es -(CH₂)_r-H, en cuyo caso R³ es W; W se elige entre ácido sulfónico y sulfonato;

p es un número entero de 3 a 6;

q se elige para que sea 2 ó 3; y

r es un número entero de 1 a 5;

y sus sales;

caracterizado porque cuando n de dos de dichos colorantes difiere en +1, uno de los números p, q y r de dichos dos colorantes difiere en -1.