REACTIVO DE LISIS PARA RECUENTO SIMULTANEO DE DIFERENTES TIPOS DE CELULAS SANGUINEAS EN UNA MUESTRA DE SANGRE.
Un reactivo que comprende:
- un compuesto estabilizador de la hemoglobina seleccionado del grupo constituido por imidazol,
derivados de imidazol, y combinaciones de los mismos;
- al menos dos sales de amonio cuaternario;
- 1,3-dimetilurea y/o sales de la misma; y
- un tampón orgánico
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DK2005/000681.
Solicitante: CHEMPAQ A/S.
Nacionalidad solicitante: Dinamarca.
Dirección: HIRSEMARKEN 1B,3520 FARUM.
Inventor/es: EKBERG,BJORN.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 14 de Abril de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- G01N33/50D6
Clasificación PCT:
- G01N15/12 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 15/00 Investigación de características de partículas; Investigación de la permeabilidad, del volumen de los poros o del área superficial efectiva de los materiales porosos (identificación de microorganismos C12Q). › Contadores del tipo Coulter.
- G01N33/50 G01N […] › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
Fragmento de la descripción:
Reactivo de lisis para recuento simultáneo de diferentes tipos de células sanguíneas en una muestra de sangre.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un reactivo para uso en la enumeración electrónica y discriminación volumétrica simultánea automática, por ejemplo por recuento Coulter, de diferentes tipos de células sanguíneas, tales como leucocitos, trombocitos, etc., en la sangre. Adicionalmente, la presente invención se refiere a un aparato de recuento Coulter (impedancia) que contiene el reactivo, por ejemplo un aparato de recuento Coulter con un cartucho desechable para caracterización de las células suspendidas en un líquido, especialmente un cartucho desechable autónomo para análisis de un solo uso, por ejemplo para análisis de un solo uso de una pequeña cantidad de sangre entera.
Antecedentes de la invención
La información acerca del contenido de leucocitos (glóbulos blancos de la sangre), sus subpoblaciones y trombocitos (plaquetas) es una herramienta importante para el médico a fin de diagnosticar diferentes enfermedades y monitorizar el tratamiento. Adicionalmente, la concentración de hemoglobina, relacionada directamente con el número de eritrocitos, en la muestra de sangre es también de gran importancia.
Por ello, se ha dedicado mucho esfuerzo a lo largo de los años al desarrollo de sistemas automáticos de recuento de las células de la sangre. Los sistemas automáticos de recuento de las células de la sangre pueden dividirse en dos grupos principales: aquéllos que se basan en el principio de clasificación de las células por impedancia (igual al principio Coulter) y aquéllos que se basan en el principio de la citometría de flujo). Ejemplos de tales sistemas automáticos son Coulter AcT Diff basado en clasificación de células por impedancia y Bayer ADVIA 120 basado en citometría de flujo. Ambos principios pueden combinarse con técnicas espectrofotométricas para análisis de componentes adicionales en la sangre, tales como la hemoglobina.
US 4.962.038 describe un sistema de reactivos que contiene un diluyente de la sangre y un agente de lisis para enumeración rutinaria de los valores tradicionales del hemograma y la determinación de leucocitos. El diluyente de la sangre comprende hidrocloruro de procaína, ADA, diacetato de clorhexidina, 1-hidroxipiridina-2-tiona, y dimetilolurea, y el agente de lisis comprende al menos una sal de amonio cuaternario y un cianuro de metal alcalino.
US 4.745.071 describe un agente diluyente, un agente de lisis, y un detergente para diferenciación entre y enumeración de linfocitos, neutrófilos y leucocitos. El diluyente de la sangre comprende 1,3-dimetilurea, 1-hidroxipiridina-2-tiona, y ADA, el agente de lisis comprende una sal individual de amonio cuaternario y cianuro de potasio, y el detergente comprende, además de los componentes del diluyente, un agente humectante de diazopón.
US 5.227.304 describe una solución diluyente en combinación con una solución detergente para enumeración rutinaria de las células de la sangre, una muestra de la sangre se divide en una parte alícuota de glóbulos rojos para enumeración de los glóbulos rojos de la sangre (eritrocitos) junto con plaquetas (trombocitos), y una parte alícuota de glóbulos blancos para enumeración de los glóbulos blancos de la sangre (leucocitos) y hemoglobina. Además de las soluciones descritas, es necesaria una solución de lisis (como se describe en US 4.745.071, véase arriba) para enumeración de la parte alícuota de las células blancas. La solución diluyente comprende imidazol, dimetilurea, EDTA, omadina sódica, triadina-10, y triadina-3, y la solución detergente comprende triadina-10, omadina sódica, y Brij 35.
US 5.958.781 describe un método para determinación de hemoglobina y leucocitos con un diluyente que comprende EDTA, imidazol, y una mezcla de hexahidro-1,3,5-tris(2-hidroxietil)-s-triazina y 2-piridinatiol-1-óxido de sodio y un ácido de lisis que comprende al menos una sal de amonio cuaternario y una sal de hidroxilamina.
US 4.286.963 describe un disolvente lítico y un método para lisis rápida de los glóbulos rojos de la sangre en sangre entera para una determinación diferencial de poblaciones de leucocitos linfoides y mieloides, y medida de hemoglobina, particularmente para uso en sistemas de recuento automático de partículas. El diluyente es una mezcla de al menos una sal de amonio cuaternario que tiene propiedades tensioactivas, y un aditivo en proporciones adecuadas, tamponada a un pH ácido de 3,5 a 5,0. El aditivo incluye 2-fenoxietanol y otros alcanoles de cadena corta sustituidos con un fenilo o fenoxi, así como ciertos compuestos polihidroxilados.
Tradicionalmente, los eritrocitos y trombocitos se cuantifican en una muestra de sangre después de la adición de una solución diluyente, en tanto que se añade un agente de lisis a la misma o a una muestra de sangre separada para liberar hemoglobina de los eritrocitos y permitir la cuantificación de los leucocitos junto con un análisis de la hemoglobina. Un análisis total a la vez de eritrocitos, trombocitos, leucocitos y hemoglobina, requiere por tanto varios pasos.
De acuerdo con ello, existe necesidad de desarrollar un reactivo que combine la función de un diluyente y un agente de lisis, y que permita simultáneamente una enumeración manual o automática de las diversas células de la sangre tales como, v.g., trombocitos y leucocitos, junto con un análisis de hemoglobina.
Una identificación y cuantificación simultáneas de leucocitos y trombocitos utilizando un solo reactivo combinado, requeriría que un agente de lisis pueda lisar los eritrocitos sin afectar significativamente a los trombocitos. Típicamente, los agentes de lisis conocidos reducen fuertemente el tamaño de los trombocitos, por lo cual, en conexión con la cuantificación, las señales generadas por los residuos de los trombocitos se solapan con el nivel de ruido de fondo de las partículas. Adicionalmente, se cree que el ruido de fondo es generado en gran parte por residuos procedentes de las membranas de los eritrocitos. Cuanto más se reduce el nivel de ruido de fondo, tanto más exactamente pueden identificarse y cuantificarse las partículas de trombocitos.
Los agentes de lisis conocidos contienen típicamente una sal cianuro y, debido a la toxicidad del cianuro de hidrógeno, tales agentes deben tener un pH alcalino. A un pH superior a 8, el tamaño de, v.g., los trombocitos cambia drásticamente. A fin de obtener un análisis simultáneamente exacto y preciso de todas las células de la sangre arriba mencionadas, junto con un análisis de la hemoglobina, el valor de pH de un sistema combinado de reactivos tiene que ser próximo a la neutralidad, es decir, muy inferior a 8. Previamente se ha descrito que un medio utilizado para enumeración de los trombocitos precisa tener, además de una osmolalidad adecuada, un pH en el intervalo de 6,5-7,6 (US 5.935.857, US 4.745.071, US 4.185.964) a fin de preservar el volumen celular de los trombocitos.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un reactivo que comprende un compuesto estabilizador de la hemoglobina/ligando de metahemoglobina seleccionado del grupo constituido por imidazol, derivados de imidazol, y combinaciones de los mismos, al menos dos sales de amonio cuaternario, 1,3-dimetilurea y/o sales de la misma; y un tampón orgánico. El reactivo es útil como diluyente y agente de lisis combinado, permitiendo un recuento o análisis simultáneo de diversas células de la sangre así como análisis de la hemoglobina.
De acuerdo con ello, la presente invención proporciona un método para determinar el contenido de células de la sangre en una muestra de sangre que comprende los pasos de: mezclar una muestra de sangre con un reactivo de acuerdo con la invención; y analizar el contenido de la muestra de sangre por empleo del principio de Coulter.
Aspectos adicionales de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción que sigue.
Descripción detallada de la invención
Es un objeto de la presente invención proporcionar un reactivo que combina la función de un diluyente y un agente de lisis, y que simultáneamente permite un recuento o análisis manual o automático de diversas células de la sangre y análisis de la hemoglobina. De este modo se hace posible la integración de dilución y lisis de una muestra de sangre en un solo paso.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un reactivo que preserva el volumen de los trombocitos y mejora la descomposición de...
Reivindicaciones:
1. Un reactivo que comprende:
2. Un reactivo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la concentración del compuesto estabilizador de hemoglobina seleccionado del grupo constituido por imidazol, derivados de imidazol, y combinaciones de los mismos en el reactivo está comprendida en el intervalo de 10 mmol/l a 100 mmol/l, tal como desde 25 mmol/l a 75 mmol/l, desde 40 mmol/l a 60 mmol/l, y preferiblemente 50 mmol/l.
3. Un reactivo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el compuesto estabilizador de hemoglobina es imidazol en una concentración de 50 mmol/l.
4. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las al menos dos sales de amonio cuaternario comprenden una combinación de cloruro de dodeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetilamonio.
5. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la concentración total de las al menos dos sales de amonio cuaternario en el reactivo está comprendida en el intervalo de 1,0 mmol/l a 10 mmol/l, tal como desde 3,0 mmol/l a 9,0 mmol/l, desde 4,5 mmol/l a 8,5 mmol/l, y preferiblemente 6,5 mmol/l.
6. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las al menos dos sales de amonio cuaternario son una combinación de cloruro de dodeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetilamonio en concentraciones de 5,6 mmol/l y 0,9 mmol/l, respectivamente.
7. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la concentración de 1,3-dimetilurea y/o sales de la misma en el reactivo está comprendida en el intervalo de 10 mmol/l a 25 mmol/l, tal como desde 12 mmol/l a 23 mmol/l, desde 14 mmol/l a 20 mmol/l, desde 16 mmol/l a 18 mmol/l, y preferiblemente 17 mmol/l.
8. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la 1,3-dimetilurea y/o sales de la misma es 1,3-dimetilurea en una concentración de 17 mmol/l.
9. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el reactivo comprende adicionalmente procaína, hidrocloruro de procaína u otras sales de la misma.
10. Un reactivo de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la concentración de hidrocloruro de procaína en el reactivo está comprendida en el intervalo de 0,2 mmol/l a 1,6 mmol/l, tal como desde 0,4 mmol/l a 1,4 mmol/l, desde 0,6 mmol/l a 1,2 mmol/l, desde 0,8 mmol/l a 1,0 mmol/l, y preferiblemente 0,9 mmol/l.
11. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tampón orgánico es un compuesto tal como ADA (ácido N-2-(acetamido)iminodiacético), HEPES (ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazina)etanosulfónico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propano-sulfónico), PIPES (ácido piperazina-N,N'-bis(2-etano-sulfónico) o combinaciones de los mismos, con una concentración comprendida en el intervalo de 2 mmol/l a 8 mmol/l, tal como desde 4 mmol/l a 6 mmol/l, desde 5 mmol/l a 5,6 mmol/l, y preferiblemente 5,3 mmol/l.
12. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tampón orgánico es ADA (ácido N-2-(acetamido)iminodiacético) con una concentración comprendida en el intervalo de 2 mmol/l a 8 mmol/l, tal como desde 4 mmol/l a 6 mmol/l, desde 5,0 mmol/l a 5,6 mmol/l, y preferiblemente 5,3 mmol/l.
13. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tampón orgánico es ADA (ácido N-2-(acetamido)iminodiacético) con una concentración de 5,3 mmol/l.
14. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la osmolalidad del reactivo se ajusta con al menos una sal inorgánica, tal como cloruro de sodio, y/o sulfato de sodio.
15. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la osmolalidad del reactivo se ajusta con cloruro de sodio y sulfato de sodio.
16. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 y 15, en donde la osmolalidad del reactivo está comprendida en el intervalo de 200 mosmol/l a 400 mosmol/l, tal como desde 250 mosmol/l a 380 mosmol/l, desde 300 mosmol/l a 350 mosmol/l, y preferiblemente 330 mosmol/l.
17. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el pH del reactivo se ajusta con un ácido, y el pH del reactivo está comprendido en el intervalo de 6 a 8, tal como desde 6,5 a 7,5, y preferiblemente 7,1.
18. Un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende imidazol en una concentración de 50 mmol/l; cloruro de dodeciltrimetilamonio en una concentración de 5,6 mmol/l; bromuro de hexadeciltrimetilamonio en una concentración de 0,9 mmol/l; 1,3-dimetilurea en una concentración de 17 mmol/l; ADA (ácido N-2-(acetamido)iminodiacético) en una concentración de 5,3 mmol/l; hidrocloruro de procaína en una concentración de 0,9 mmol/l; y agua desionizada;
en donde el pH se ajusta a 7,1 con ácido sulfúrico diluido y la osmolalidad se ajusta con cloruro de sodio y sulfato de sodio.
19. Un revestimiento que comprende un reactivo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-18.
20. Un método de determinación del contenido de células de la sangre en una muestra de sangre, comprendiendo el método los pasos de:
21. Un método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el contenido de trombocitos se determina por el paso ii).
22. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 y 21, en donde el contenido de leucocitos se determina por el paso ii).
23. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20-22, en donde una o más subpoblaciones de leucocitos tales como, v.g., los linfocitos, monocitos y/o macrófagos se determinan por el paso ii).
24. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20-23, en donde el método comprende adicionalmente
25. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20-24, en donde la relación en volumen sangre:reactivo está comprendida en el intervalo de 1:10.000 a 1:200, tal como desde 1:1000 a 1:300, desde 1:600 a 1:400, desde 1:550 a 1:450, y con preferencia aproximadamente 1:500.
26. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20-25, en donde
el paso i) se realiza en un cartucho adecuado para uso en un aparato para recuento de células en una muestra de sangre, en cuyo cartucho el reactivo está presente en una cámara de recogida que está conectada con una cámara de mezcla en la cual el reactivo se mezcla con la muestra de sangre; y
el paso ii) se realiza haciendo pasar subsiguientemente la muestra de sangre que comprende las células a través de un orificio posicionado entre la cámara de mezcla y una cámara de recogida, con lo cual el contenido de la sangre se analiza por empleo del principio de Coulter por medios de caracterización de células.
27. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24-26, en donde el paso iii) se realiza en una cámara de dosificación volumétrica conectada a la cámara de recogida y adaptada para cuantificación espectrofotométrica.
28. Uso de un reactivo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-18, para determinación del contenido de trombocitos en una muestra de sangre.
29. Uso de acuerdo con la reivindicación 28 para la determinación simultánea del contenido de leucocitos en la misma muestra de sangre.
30. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 y 29 para determinación simultánea de una o más subpoblaciones de leucocitos en la misma muestra de sangre.
31. Uso de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la subpoblación de leucocitos incluye linfocitos, monocitos y/o granulocitos.
32. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27-29 para determinación del contenido de hemoglobina en la misma muestra de sangre.
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