Molécula de ácido nucleico aislada de plantas de algodón que codifica para una quitinasa endógena de algodón,

en la que la molécula de ácido nucleico se expresa preferentemente en fibras durante la deposición de la pared secundaria y en la que la molécula de ácido nucleico:

a. comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una quitinasa endógena de algodón y que hibrida con una molécula de ADN que tiene una secuencia según la SEQ. ID. No. 1 en condiciones rigurosas caracterizadas por un tampón de hibridación que comprende 1 x SSC a una temperatura de 61ºC;

b. tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ. ID. No. 1; o

c. codifica para la proteína o el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No

Quitinasa que codifica para una molécula de ADN de algodón expresada preferentemente en fibras durante la deposición de la pared celular secundaria y el correspondiente promotor.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un gen que se expresa en fibras durante la deposición de la pared celular secundaria y al promotor del correspondiente gen.

Antecedentes de la invención

Las células fibrosas de algodón (Gossypium hirsutum L. y otras especies Gossypium incluyendo G. barbadense L., G. arboreum L., y G. herbaceous L.), un cultivo de enorme importancia económica para la agricultura mundial, son células epidérmicas diferenciadas de la vaina de la semilla. En la madurez, la célula fibrosa, considerada desde el interior hacia el exterior, consiste en un lumen celular, una pared celular secundaria, una pared celular primaria y una cutícula cerosa delgada. La pared celular primaria está constituida por compuestos pécticos, componentes de hemicelulosa, celulosa y proteína. La pared celular secundaria consiste principalmente (aproximadamente el 95%) en celulosa con pequeños porcentajes de otros componentes aún no identificados de manera concluyente.

El desarrollo de la fibra de algodón se caracteriza por las fases de iniciación, deposición de la pared celular primaria, deposición de la pared celular secundaria y desecación. Durante la fase de pared primaria del desarrollo de fibras, se produce la deposición de la pared primaria para facilitar la elongación de las fibras. Durante la fase de la pared secundaria del desarrollo de fibras, se produce la deposición de la pared secundaria para llevar a cabo el espesamiento de las fibras. La deposición de la pared primaria y secundaria implica la síntesis de todos los componentes de la pared celular característicos de cada fase y el ensamblaje de las moléculas en una pared celular organizada fuera de la membrana plasmática. Se requieren muchos cientos de genes para la diferenciación y el desarrollo de la fibra vegetal. El trabajo sobre las proteínas fibrosas traducidas in vitro (Delmer et al., New Approaches to the Study of Cellulose Biosynthesis, J. Cell Sci. Suppl., 2:33-50 (1985)), proteína aislada de fibra (Graves y Stewart, Analysis of the Protein Constituency of Developing Cotton Fibers, J. Exp. Bot., 39:59-69 (1988)) y el análisis de genes particulares (Wilkins et al., Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers, en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Improvement, and Textile Processing, Haworth Press: Nueva York, págs. 231-270 (1999)) sugiere claramente la expresión génica diferencial durante diversas fases del desarrollo de la célula. Sin embargo, se han identificado sólo algunos de los genes implicados en la biosíntesis del gran número de ceras, polisacáridos, enzimas o proteínas estructurales que potencian las fibras o específicas de fibras (John et al., Gene Expression in Cotton (Gossypium hirsutum L.) Fiber: Cloning of the mRNAs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5769-5773 (1992); John, Characterization of a Cotton (Gossypium hirsutum L.) Fiber mRNA (Fb-B6), Plant Physiol., 107:1477-1478 (1995)). Puesto que estos genes y sus interacciones con el entorno determinan la calidad de la fibra, se considera que su identificación y caracterización es un aspecto importante de la mejora de los cultivos de algodón.

En particular, cómo se sintetizan las paredes celulares secundarias, cómo ayudan a la función, adaptación y defensa de la planta y cómo sus propiedades se traducen en utilidad industrial son cuestiones importantes relacionadas con los mecanismos biológicos básicos, la ecología y la mejora de la planta. Las paredes celulares secundarias vegetales se sintetizan en algunos tipos de células especializados para facilitar funciones particulares, tales como la conducción de agua a larga distancia (elementos traqueales), el control de la transpiración (células oclusivas) y la dispersión de semillas (fibras de algodón). Estas paredes celulares secundarias tienen un mayor contenido en celulosa de alta resistencia a la tracción, que normalmente supera el 40% en peso y son mucho más gruesas que las paredes celulares primarias. Por consiguiente, su contenido en hemicelulosa, pectina y proteína se reduce, produciéndose la reducción más extrema en el caso de las paredes celulares secundarias de fibra de algodón que son aproximadamente el 95% de celulosa. Por otra parte, durante la deposición de la pared primaria, el contenido en celulosa es normalmente del 9-30% (p/p) (Meinert et al., Changes in Biochemical Composition of the Cell Wall of the Cotton Fiber During Development, Plant Physiol., 59:1088-1097 (1977); Darvill et al., The Primary Cell Walls of Flowering Plants, The Biochemistry of Plants, 1:91-162 (1980); Smook, Handbook for Pulp and Paper Technologists, Vancouver, Canadá: Angus Wilde Publications, pág. 15 (1992)). Ya que las paredes celulares secundarias son fuertes y representan una fuente voluminosa de celulosa química, se han aprovechado como importantes recursos renovables, por ejemplo en fibras de lana y algodón.

Las células fibrosas de algodón tienen dos fases de desarrollo distintas que incluyen la deposición de la pared secundaria. Muchos estudios del aumento del peso y la longitud de la fibra, la morfología, la composición de la pared celular, las tasas de síntesis de celulosa y la expresión génica han confirmado el resumen de las fases del desarrollo de fibras presentado a continuación, y revistas actuales contienen muchas referencias primarias para confirmar estos hechos (Delmer, Cellulose Biosynthesis in Developing Cotton Fibers, en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, Nueva York, New York: Haworth Press, págs. 85-112 (1999); Ryser, Cotton Fiber Initiation and Histodifferentiation, en Basra ed., Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, Nueva York, New York: Haworth Press, págs. 1-46 (1999); Wilkins et al., Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers, en Basra, ed., Cotton Fibers: Developmental Biology Quality Improvement, and Textile Processing, Nueva York, New York: Haworth Press, págs. 231-270 (1999)). Tras la iniciación de las fibras mediante la expansión de una célula epidérmica por encima de la superficie, comienza la elongación de las fibras. Se requiere la deposición de la pared primaria para facilitar la elongación de las fibras, y la deposición de la pared primaria continua sola durante al menos 12 días tras la iniciación de las fibras. Este periodo representa exclusivamente la fase de la pared primaria del desarrollo de fibras. Entonces comienza la deposición de la pared secundaria mientras que la deposición de la pared primaria continua, aunque normalmente a una velocidad más lenta. Esta fase del desarrollo de fibras representa la transición entre la deposición de la pared primaria y secundaria, y comienza normalmente en G. hirsutum L. entre 14 - 17 días tras la antesis (DPA). Posteriormente, la elongación de las fibras y la deposición de la pared primaria cesan, normalmente entre 18 - 24 DPA, y la deposición de la pared secundaria continua exclusivamente hasta 34 - 50 DPA. La variación en el tiempo de iniciación y duración de cada fase del desarrollo de fibras depende del cultivar de algodón y las condiciones de temperatura (DeLanghe, Lint Development en Mauney, eds., Cotton Physiology, Memphis, Tennessee: The Cotton Foundation, págs. 325-349 (1986); Haigler et al., Cultured Cotton Ovules as Models for Cotton Fiber Development Under Low Temperatures, Plant Physiol., 95:88-96 (1991); Thaker et al., Genotypic Variation and Influence of Diurnal Temperature on Cotton Fiber Development, Field Crops Research, 22:129-141 (1989)). Por ejemplo, en G. barbadense L. cultivado en campo, no se produjo la deposición de la pared secundaria extensa hasta después de 20 DPA, la elongación continuó hasta 39 DPA y la deposición de la pared secundaria cesó a los 48 DPA (Schubert et al., Growth and Development of the Lint Fibers of Pima S-4 Cotton, Crop Sci., 16:539-543 (1976)).

Las tasas de síntesis de celulosa cambian desde baja, hasta media, hasta alta, respectivamente, en las fases de la pared primaria, la transición y la pared secundaria del desarrollo de fibras (Meinert et al., Changes in Biochemical Composition of the Cell Wall of the Cotton Fiber During Development, Plant Physiol., 59:1088-1097 (1977); Martin, Cool-Temperature-Induced Changes in...

1. Molécula de ácido nucleico aislada de plantas de algodón que codifica para una quitinasa endógena de algodón, en la que la molécula de ácido nucleico se expresa preferentemente en fibras durante la deposición de la pared secundaria y en la que la molécula de ácido nucleico:

2. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la fibra es fibra de algodón.

3. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 2, en la que la molécula de ácido nucleico se expresa en fibras de algodón comenzando de 14 a 17 días tras la antesis (DPA).

4. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 3, en la que la molécula de ácido nucleico se expresa en fibras de algodón hasta la finalización de la deposición de la pared secundaria.

5. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 3, en la que la molécula de ácido nucleico se expresa en fibras de algodón hasta los 31 DPA.

6. Polipétido codificado por la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Polipéptido según la reivindicación 6, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No. 2.

8. Constructo de ADN que comprende un promotor operativamente unido en 5' a una molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 1 a 5 y una región reguladora en 3' operativamente unida a dicha molécula de ácido nucleico, en el que dicho promotor es foráneo a dicha molécula de ácido nucleico.

9. Célula vegetal que comprende un constructo de ADN según la reivindicación 8.

10. Célula vegetal transgénica que comprende un transgén, comprendiendo dicho transgén un constructo de ADN según la reivindicación 8.

11. Célula vegetal según la reivindicación 9 ó 10, en la que la planta se selecciona del grupo que consiste en algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute; kenaf, miraguano, coco, bambú, musgo español, abacá y Agave spp.

12. Planta que comprende en sus células un constructo de ADN según la reivindicación 8.

13. Planta transgénica que comprende en sus células un transgén, comprendiendo dicho transgén un constructo de ADN según la reivindicación 8.

14. Planta según la reivindicación 12 ó 13, en la que la planta se selecciona del grupo que consiste en algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, kenaf, miraguano, coco, bambú, musgo español, abacá y Agave spp.

15. Semilla vegetal que comprende un constructo de ADN según la reivindicación 8.

16. Semilla vegetal transgénica que comprende un transgén, comprendiendo dicho transgén un constructo de ADN según la reivindicación 8.

17. Semilla vegetal según la reivindicación 15 ó 16, en la que la planta se selecciona del grupo que consiste en algodón, maíz, caña de azúcar, arroz, lino, cáñamo, ramio, yute, kenaf, miraguano, coco, bambú, musgo español, abacá y Agave spp.

18. Método de regulación del contenido en celulosa de una fibra vegetal que comprende la etapa de transformar una planta con un constructo de ADN según la reivindicación 8.

19. Método para proporcionar una planta que tiene resistencia frente a insectos y hongos que comprende la etapa de transformar una planta con un constructo de ADN según la reivindicación 8.