PRUEBA DIAGNOSTICA DE TUBERCULOSIS.

Un procedimiento para determinar la infección en un ser humano por una micobacteria que expresa ESAT-6,

o una exposición de un ser humano a la misma, que comprende:

(i) poner en contacto una población de células T de dicho ser humano con el péptido representado por la ID SEC nº: 1 y, opcionalmente, uno o más péptidos adicionales representados por las ID SEC n os 2 a 11 y

(ii) determinar in vitro si las células T de dicha población de células T reconocen dicho/s péptido/s

Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W9903635GB.

Solicitante: ISIS INNOVATION LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: EWERT HOUSE, EWERT PLACE,SUMMERTOWN, OXFORD OX2 7BZ.

Inventor/es: LALVANI,AJIT,NUFFIELD DEP. OF CLINICAL MEDICINE, PATHAN,ANSAR A.,NUFFIELD DEP. OF CLINICAL MED.

Fecha de Publicación: 16 de Febrero de 2010.

Fecha Concesión Europea: 14 de Octubre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

C07K14/35 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Mycobacteriaceae (F).

Clasificación PCT:

A61K31/70 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Hidratos de carbono; Azúcares; Sus derivados (sorbitol A61K 31/047).
A61K38/10 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Péptidos que tienen de 12 a 20 aminoácidos.
C07K14/35 C07K 14/00 […] › de Mycobacteriaceae (F).
C07K16/12 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales bacterianos.
C07K7/08 C07K […] › C07K 7/00 Péptidos con 5 a 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados. › con 12 a 20 aminoácidos.
C12Q1/68 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
G01N33/569 G01N 33/00 […] › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.
G01N33/68 G01N 33/00 […] › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

Clasificación antigua:

A61K31/70 A61K 31/00 […] › Hidratos de carbono; Azúcares; Sus derivados (sorbitol A61K 31/047).
A61K38/10 A61K 38/00 […] › Péptidos que tienen de 12 a 20 aminoácidos.
C07K14/35 C07K 14/00 […] › de Mycobacteriaceae (F).
C07K16/12 C07K 16/00 […] › contra materiales bacterianos.
C07K7/08 C07K 7/00 […] › con 12 a 20 aminoácidos.
C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
G01N33/569 G01N 33/00 […] › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.
G01N33/68 G01N 33/00 […] › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

Fragmento de la descripción:

Prueba diagnóstica de tuberculosis.

La presente invención versa acerca de un procedimiento de diagnóstico de una infección micobacteriana, en particular una infección de Mycobacterium tuberculosis. También versa acerca de péptidos y un kit que puede utilizarse para llevar a cabo el procedimiento de diagnóstico.

Las actuales pruebas de diagnóstico para la enfermedad de tuberculosis son bien lentas o bien poco fiables. Las pruebas que dependen de la identificación de la micobacteria que provoca la tuberculosis son lentas porque el cultivo de la micobacteria puede llevar hasta 8 semanas. En algunos casos resulta imposible cultivar la bacteria. Además, la obtención de muestras para detectar la presencia de la micobacteria a menudo requiere procedimientos invasivos.

Una prueba alternativa es la prueba de la tuberculina en la piel (TST) o la prueba de Mantoux que están basadas en la detección de una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) a una administración intradérmica de un derivado proteico purificado de la micobacteria. Aunque esta prueba lleva menos tiempo que las pruebas que dependen de la identificación de la micobacteria, es menos fiable debido al uso extendido de BCG como una vacuna contra la tuberculosis. La BCG está estrechamente relacionada con M. tuberculosis y, por lo tanto, individuos que han sido vacunados con BCG pueden reaccionar de manera positiva a una TST. Además, no se detecta una gran proporción de gente con tuberculosis activa por medio de una TST debido a una anergia inmune cutánea. Por lo tanto, la TST tiene una especificidad y una sensibilidad bajas.

Los inventores han descubierto, utilizando un ensayo que detecta la liberación de IFN-? de las células T, 8 péptidos de la proteína ESAT-6 de M. tuberculosis que son reconocidos por las células T de una elevada proporción de pacientes con tuberculosis, y en particular el péptido representado por la ID SEC nº: 1 es reconocido por el 57% de pacientes analizados y por el 68% de contactos sanos analizados. Estos contactos han sido expuestos a tuberculosis pulmonar abierta. Los inventores han combinado estos péptidos en un panel de péptidos que cuando se utiliza junto con una prueba diagnóstica proporciona una especificidad del 91,5%, y una sensibilidad del 96%. Los inventores también han descubierto otros tres péptidos de ESAT-6 que son reconocidos por las células T de los pacientes con tuberculosis que pueden ser utilizados para aumentar la sensibilidad a la prueba diagnóstica.

De manera ventajosa, la BCG no tiene el gen ESAT-6 y, por lo tanto, a diferencia de pruebas anteriores, incluyendo la TST, la prueba diagnóstica puede distinguir entre pacientes con tuberculosis y pacientes que han sido vacunados con BCG.

Brandt et al. (1996), Journal of Immunology, 157, 3527-33 dieron a conocer epítopes de célula T de ESAT-6 que son reconocidos por ratones. Sin embargo, no es posible predecir en base a los epítopes que son reconocidos por ratones qué epítopes serán reconocidos por seres humanos. Al igual que otras diferencias en el procesamiento, la presentación y el reconocimiento de epítopes, los ratones tienen distintas moléculas MHC que los seres humanos, y por lo tanto se espera que reconozcan distintos epítopes que los seres humanos. Esto se demuestra por el hecho de que Brandt et al no identificaron en ratones algunos epítopes de célula T de ESAT-6 que fue descubierto subsiguientemente por los presentes inventores que eran reconocidos por los seres humanos.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para determinar la infección en un ser humano por una micobacteria que expresa ESAT-6, o una exposición de un ser humano a la misma, que comprende (i) poner en contacto una población de células T de dicho ser humano con el péptido representado por la ID SEC nº: 1 y, opcionalmente, uno o más péptidos adicionales representados por las ID SEC n^os: 2 a 11 y (ii) determinar in vitro si las células T de dicha población de células T reconocen dicho/s péptido/s. En las realizaciones preferentes, se utilizan al menos todos de los péptidos representados por las ID SEC n^os: 1, 5, 6 y 8; o por las ID SEC n^os 1 a 8.

La invención también proporciona un kit para llevar a cabo un procedimiento de la invención que comprende un panel de péptidos, por ejemplo, el péptido representado por la ID SEC nº: 1 y uno o más péptidos adicionales representados por las ID SEC n^os: 2 a 11 y opcionalmente un medio para detectar el reconocimiento de los péptidos por las células T.

De manera alternativa, se pueden proporcionar polinucleótidos que son capaces de codificar en células humanas dicho panel de péptidos.

Descripción detallada de la invención

A continuación se muestran las secuencias de ID SEC nos 1 a 11:

ID SEC nº 1:	MTEQQWNFAGIEAAA	(ES1)

ID SEC nº 2:	SAIQGNVTSIHSLLD	(ES4)

ID SEC nº 3:	QKWDATATELNNALQ	(ES12)

ID SEC nº 4:	NNALQNLARTISEAG	(ES14)

ID SEC nº 5:	NLARTISEAGQAMAS	(ES15)

ID SEC nº 6:	WNFAGIEAAASAIQG	(ES2)

ID SEC nº 7:	EGKQSLTKLAAAWGG	(ES7)

ID SEC nº 8:	YQGVQQKWDATATEL	(ES11)

ID SEC nº 9:	NVTSIHSLLDEGKQS	(ES5)

ID SEC nº 10:	IEAAASAIQGNVTSI	(ES3)

ID SEC nº 11:	TATELNNALQNLART	(ES13)

Se puede aplicar un procedimiento de diagnóstico de la invención a un ser humano que tiene una infección micobacteriana activa o latente, o que ha tenido dicha infección recientemente. Una persona escogida para el uso de dicho procedimiento puede dar positivo o negativo en una prueba de Mantoux. Pueden estar en riesgo de una infección micobacteriana, normalmente por razones socioeconómicas o pueden tener una predisposición genética o adquirida a una infección micobacteriana.

Una persona analizada conforme a la invención puede ser un contacto sano que ha sido expuesto a una micobacteria. Normalmente la exposición es a tuberculosis pulmonar, como tuberculosis pulmonar "abierta" que es un frotis positivo de esputo a.f.b. (bacilos ácido-alcohol resistentes). Por lo tanto, el procedimiento se puede utilizar para hacer un seguimiento de los contactos sanos de individuos con dichas infecciones de tuberculosis. El procedimiento también se puede utilizar para llevar a cabo encuestas de la población para medir el número de individuos en una población que tienen una infección micobacteriana o que son contactos sanos.

La micobacteria expresa ESAT-6. En general, la ESAT-6 tiene una secuencia que comprende una o más de las secuencias representadas por las ID SEC nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 o por uno o más homólogos de estas secuencias. Dichos homólogos pueden unir un receptor de la célula T que reconoce el péptido equivalente representado por la ID SEC nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 y/o puede inhibir la unión a un receptor de la célula T de dicho péptido equivalente.

La micobacteria es normalmente M. tuberculosis. La micobacteria puede ser M. marinum o M. kansasii. Se puede utilizar el patrón de síntomas clínicos para distinguir entre estos dos organismos y M. tuberculosis. La micobacteria puede ser M. bovis. Este es capaz de infectar a seres humanos.

Las células T que reconocen el péptido en el procedimiento son normalmente células T que han sido sensibilizado previamente in vivo al antígeno de una micobacteria. Estas células T con experiencia antigénica están presentes en general en la sangre periférica de un huésped que ha sido expuesto a la micobacteria a una frecuencia de 1 en 10⁶ a 1 en 10³ de células mononucleares de sangre periférica...

Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para determinar la infección en un ser humano por una micobacteria que expresa ESAT-6, o una exposición de un ser humano a la misma, que comprende:

^os

in vitro

2. El uso del péptido representado por la ID SEC nº: 1 y, opcionalmente, uno o más péptidos adicionales representados por las ID SEC n^os: 2 a 11, para la preparación de una composición para su uso en la determinación de una infección en un ser humano por una micobacteria que expresa ESAT-6, o una exposición de un ser humano a la misma, comprendiendo dicho uso la determinación de si las células T de dicho ser humano reconocen dicho/s péptido/s.

3. Un procedimiento o un uso conforme a la reivindicación 1 o 2, en el que se emplea un panel de péptidos que consiste en, además del péptido representado por la ID SEC nº: 1, uno o más péptidos seleccionados de los péptidos representados por las ID SEC n^os 2 a 11.

4. Un procedimiento o un uso conforme a la reivindicación 3, en el que se emplean al menos los péptidos representados por las ID SEC n^os 1 a 8.

5. Un procedimiento o un uso conforme a la reivindicación 4, en el que se emplean uno o más péptidos adicionales seleccionados de los péptidos representados por las ID SEC n^os 9, 10 y 11.

6. Un procedimiento o un uso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se determina el reconocimiento del o de los péptidos por las células T al determinar la secreción de una citocina de las células T.

7. Un procedimiento o un uso conforme a la reivindicación 6, en el que se determina la secreción de IFN-? de las células T.

8. Un procedimiento o un uso conforme a la reivindicación 7, en el que se determina la secreción de IFN-? de las células T al permitir que el IFN-? secretado se una a un anticuerpo inmovilizado específico a la citocina y al determinar luego la presencia de un complejo de anticuerpo/citocina.

9. Un procedimiento o un uso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células T son células ex vivo recién aisladas de la sangre periférica.

10. Un procedimiento o un uso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las células T son cultivadas previamente in vitro con el o los péptidos.

11. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 9, en el que las células T entran en contacto con un panel de péptidos representados por las ID SEC n^os 1 a 8.

12. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 11, en el que se expande dicho panel para incluir adicionalmente uno o más péptidos adicionales seleccionados de los péptidos de las ID SEC n^os 9 a 11.

13. Un procedimiento o un uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, 11 y 12, en el que dichos péptidos forman parte de un fondo común.

14. Un procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se determina la presencia de una micobacteria que expresa ESAT-6 en lo que se supone que es un contacto sano que ha estado expuesto a dicha micobacteria.

15. Un procedimiento o un uso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la micobacteria es M. tuberculosis o M. bovis.

16. Un kit para llevar a cabo un procedimiento o un uso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que comprende dicho panel de péptidos, y opcionalmente un medio para detectar el reconocimiento de un péptido por las células T.

17. Un kit conforme a la reivindicación 16, que incluye un anticuerpo al IFN-?.

18. Un kit conforme a la reivindicación 17, en el que dicho anticuerpo está inmovilizado en un soporte sólido y que también incluye, opcionalmente, un medio para detectar cualquier complejo de anticuerpo/IFN-?.

19. El uso de un polinucleótido que codifica el péptido representado por la ID SEC nº: 1 y, opcionalmente, uno o más polinucleótidos adicionales que codifican uno o más péptidos adicionales representados por las ID SEC n^os: 2 a 11, para la preparación de una composición para su uso en la determinación de una infección en un ser humano por una micobacteria que expresa ESAT-6, o una exposición de un ser humano a la misma, comprendiendo dicho uso la determinación de si las células T de dicho ser humano reconocen dicho/s péptido/s.

20. Una composición farmacéutica que comprende un panel de péptidos como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o uno o más polinucleótidos que codifican los péptidos de dicho panel en células humanas, junto con un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptable.

21. El péptido representado por la ID SEC nº: 1 y, opcionalmente, uno o más péptidos adicionales representados por las ID SEC n^os 2 a 11, para su uso en la determinación de una infección en un ser humano por una micobacteria que expresa ESAT-6, o una exposición de un ser humano a la misma.

22. Un polinucleótido que codifica el péptido representado por la ID SEC nº: 1 y, opcionalmente, uno o más polinucleótidos adicionales que codifican uno o más péptidos adicionales representados por las ID SEC n^os 2 a 11, para su uso en la determinación de una infección en un ser humano por una micobacteria que expresa ESAT-6, o una exposición de un ser humano a la misma.

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