PROTEINAS DE FUSION FC-INTERFERON-BETA.

Una proteína de fusión Fc-interferón-ß con plegamiento mejorado y agregación reducida que comprende:

(i) una región de Fc de inmunoglobulina; y

(ii) una proteína de interferón ligada por unión de péptido o una secuencia ligadora de péptido al terminal carboxi de la región Fc de inmunoglobulina, en donde la proteína interferón comprende sustituciones de aminoácido comparado con la secuencia de interferón madura natural en las posiciones 17 y 50 y 131 y 140, o 17 y 57 y 131 y 140

Proteínas de fusión Fc-interferón-ß.

Campo de la invención

La invención se relaciona con Proteínas de fusión Fc. Más específicamente, la invención se relaciona con expresión de alto nivel y secreción de Proteínas de fusión Fc-interferón-beta y formas variantes de las mismas, y métodos para elaborar y utilizar tales proteínas.

Antecedente de la invención

Los interferones son polipéptidos de cadena sencilla secretados por la mayoría de células de animal en respuesta a una variedad de estímulos, que incluyen virus, mitógenos y citoquinas. Los interferones participan en la regulación de las funciones celulares y median los efectos inmunomoduladores, antiproliferativos, y antivíricos. Así, ellos son de gran interés terapéuticamente. Los interferones nativos se dividen en tres tipos principales, con base en los tipos de células de las cuales existen principalmente derivados, a saber, interferón-ß (de leucocitos), interferón-ß (de fibroblastos), interferón-ß (de células inmunes). Interferón-ß (IFN-ß) que exhibe varias actividades inmunológicas y biológicas y como un resultado tiene aplicaciones potenciales en inmunoterapia, terapias antineoplásicas, anticáncer y antivíricas. Se han conducido y se conducen numerosas investigaciones y ensayos clínicos con base en propiedades anticáncer y antivíricas tipo intacto y IFN-ß recombinante. También se han conducido ensayos clínicos utilizando IFN-ß recombinante en el tratamiento de esclerosis múltiple.

La mayoría de las citoquinas, que incluyen IFN-ß nativo, tienen vidas útiles circulantes relativamente cortas. Posteriormente, con el fin de que el IFN-ß sea efectivo como un agente terapéutico, se puede administrar en dosis altas y frecuentes a un paciente; sin embargo, esto frecuentemente conduce a efectos colaterales tóxicos. Por lo tanto, es altamente deseable producir formas de IFN-ß que han prolongado las vidas útiles circulantes comparado con la citoquina nativa. Adicionalmente, para propósitos de producción es útil producir formas de IFN-ß que son fáciles de expresar y purificar en grandes cantidades.

El IFN-ß humano (huIFN-ß) es una glucoproteína de 166 aminoácidos y tiene una estructura de manojo de cuatro hélices. El huIFN-ß recombinante se puede producir comúnmente para uso como un terapéutico en un sistema de expresión de mamífero o procariótico. Sin embargo, cuando las proteínas que se secretan normalmente, tal como huIFN-ß, en un ambiente de mamífero se producen en un procariote, necesita ser dirigido el efecto de la expresión procariótica en el plegamiento de proteína y en modificaciones post-traduccionales potenciales. Por ejemplo, en células de mamífero, la mayoría de las proteínas destinadas para el ambiente extracelular se pliegan en el ambiente oxidado del retículo endoplásmico (ER), que promueve la formación correcta de enlaces disulfuro. En contraste, el ambiente de reducción de citosol procariótico interfiere con la formación de enlaces cisteína. Adicionalmente, las proteínas expresadas en sistemas procarióticos carecen de algunas modificaciones post-transduccionales, tal como glucosilación ligada a N, que ayudan de forma similar en el plegado correcto de la proteína, incrementa la estabilidad de la proteína plegada, y reduce la inmunogenicidad de la proteína administrada.

Por ejemplo, cuando el IFN-ß de tipo intacto se expresa en un sistema de expresión procariótico, este no se pliega apropiadamente y forma agregados. Esto se puede superar al mutar la cisteína libre en la posición 17 de la proteína IFN-ß madura a, por ejemplo, una serina. Esta cisteína en la posición 17 no se involucra en una unión disulfuro. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,737,462. En contraste, cuando el IFN-ß tipo intacto se produce en un sistema de expresión eucariótico, cuando el ambiente es apropiado para el plegado correcto de la proteína IFN-ß, no se observan plegado impropio ni agregación. Debido a que la proteína IFN-ß parece plegar apropiadamente y no agregar cuando se expresa en un sistema de expresión eucariótico, esto sugiere que la glucosilación juega un papel importante en plegado propio de la proteína IFN-ß. El IFN-ß recombinante se produce en un sistema de expresión eucariótico que experimenta glucosilación, aunque no puede tener el patrón de glucosilación preciso del IFN-ß nativo''. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,795,779. Aunque la glucosilación de IFN-ß no parece ser esencial para su actividad biológica, la actividad específica del IFN-ß glucosilado en bioensayos es mayor que la de la forma no glucosilada. De hecho, el IFN-ß producido en un sistema de expresión eucariótico, tal como un sistema de expresión de mamífero, no se agrega sustancialmente, pero forma agregados cuando se remueve el grupo funcional glicano. Por lo tanto, la forma glucosilada de IFN-ß es deseable para uso terapéutico ya que sus propiedades biofísicas son más cercanas que aquellas de la proteína nativa de la forma no glucosilada.

Otra posibilidad para mejorar las propiedades biológicas de IFN-ß es reducir o eliminar la inmunogenicidad: la WO 02/74783 describe una proteína de fusión Fc-IFNß, en donde la porción IFN-ß se modifica en las posiciones 50, 57 y 130 y muestra una respuesta inmune reducida.

Adicionalmente, se ha encontrado que ligar una proteína de interés "X" a un dominio Fc de inmunoglobulina "Fc" para crear una proteína de fusión Fc-X ("inmunofusina") generalmente tiene el efecto de incrementar la producción de proteína significativamente. Esto se considera que ocurre, en parte, debido a que el grupo funcional Fc de la proteína de fusión, comúnmente denominado como el casete de expresión, se diseña para secreción eficiente de la proteína de fusión, y en parte debido a que se producen las proteínas y se secreten de células de mamífero que son normalmente activas para secreción. Una ventaja adicional de crear Proteínas de fusión Fc-X es que las inmunofusinas resultantes exhiben una vida media circulante incrementada cuando se compara con las proteínas libres de interés, que puede ser una ventaja terapéutica significativa.

Existe, por lo tanto, una necesidad en la técnica de inmunofusinas biológicamente activas que incluyen un grupo funcional Fc fusionado a un grupo funcional IFN-ß optimizado por tener propiedades biofísicas que son cercanas a aquellas del IFN-ß nativo.

Resumen de la invención

La invención proporciona métodos y composiciones para expresar proteínas de fusión Fc-IFN-ß biológicamente activas, solubles y variantes de las mismas (Fc-IFN-ß^sol), Las proteínas de fusión Fc-IFN-ß^sol de la invención demuestran propiedades biológicas mejoradas sobre las proteínas Fc-IFN-ß no alteradas tal como solubilidad incrementada, vida media circulante prolongada, actividad biológica mejorada, e inmunogenicidad reducida.

Para mejorar la vida útil circulante de IFN-ß, la invención proporciona una proteína de fusión que incluye una proteína de fusión Fc-IFN-ß que incluye una región de Fc de inmunoglobulina y una proteína IFN-ß ligada al terminal carboxi de la región Fc de inmunoglobulina. Para mejorar el plegamiento y para reducir la agregación, la proteína IFN-ß incluye sustituciones de aminoácido en las posiciones 17, 50 o 57, 130, 131, 136, y 140, que corresponden a interferón-ß maduro natural.

En una realización, las sustituciones de alteración de aminoácido serina, alanina, valina o metionina en lugar de cisteína en la posición 17. En otra realización, las sustituciones de alteración de aminoácido histidina en lugar de fenilalanina en la posición 50. En todavía otra realización, las sustituciones de alteración de aminoácido alanina en lugar de leucina en la posición 57, mientras que en una realización adicional, las sustituciones de alteración de aminoácido alanina en lugar de leucina en la posición 130. Una realización adicional permite una alteración de aminoácido que sustituye alanina en lugar de histidina en la posición 131, mientras que una realización adicional contempla que sustituye alanina en lugar de lisina en la posición 136. En todavía otra realización, las sustituciones de alteración de aminoácido alanina o treonina en lugar de histidina en la posición 140.

La región Fc de inmunoglobulina puede incluir una región de pivote de inmunoglobulina y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En una realización, la región Fc se deriva de IgG4, mientras que en otra ésta se deriva de IgG1, y en todavía otra ésta se deriva de IgG2. En otra realización,...

1. Una proteína de fusión Fc-interferón-ß con plegamiento mejorado y agregación reducida que comprende: