PROTEINA RECOMBINANTE QUE CONTIENE UN FRAGMENTO C-TERMINAL DE MSP-1 DE PLASMODIUM.

LA INVENCION SE REFIERE A UNA PROTEINA RECOMBINANTE, PRODUCIDA EN UN SISTEMA DE BACULOVIRUS,

CUYA SECUENCIA POLIPEPTIDICA CONSTITUTIVA ESENCIAL ES LA DE UN FRAGMENTO C - TERMINAL DE 19 KILODALTONES (P19) DE LA PROTEINA 1 DE SUPERFICIE (PROTEINA MSP 1) DE LA FORMA MEROZOITA DE UN PARASITO DE TIPO PLASMODIUM, EN PARTICULAR PLASMODIUM FALCIPARUM, INFECCIOSO PARA EL HOMBRE. DICHO FRAGMENTO C - TERMINAL PERMANECE NORMALMENTE ANCLADO A LA SUPERFICIE DEL PARASITO AL TERMINO DE SU FASE DE PENETRACION EN ERITROCITOS HUMANOS CON OCASION DE UN CICLO INFECCIOSO. ESTA PROTEINA RECOMBINANTE ES APLICABLE A LA PRODUCCION DE VACUNAS CONTRA LA MALARIA

Proteína recombinante que contiene un fragmento C-terminal de MSP-1 de Plasmodium.

La presente invención se refiere a nuevos principios activos de vacunas derivados de la proteína mayor de superficie de formas merozoitas de un Plasmodium infeccioso unos mamíferos, especialmente el ser humano, conocida más generalmente con la designación MSP-1.

Esta proteína ya ha sido objeto de numerosos estudios. Se sintetiza en la fase esquizonte de los parásitos de tipo Plasmodium, en particular Plasmodium falciparum, y se expresa en forma de uno de los constituyentes principales de la superficie de los merozoitos tanto durante el estado hepático como durante el estado eritrocitario del paludismo (1, 2, 3, 4). Debido al carácter predominante y a la conservación en todas las especies de Plasmodium conocidas de esta proteína, se ha sugerido que podría representar un candidato para la constitución de vacunas anti-palúdicas (5, 6).

También ocurre lo mismo para unos fragmentos de esta proteína, en particular unos productos naturales de escisión de los cuales se observa la formación, por ejemplo durante la invasión por el parásito de los eritrocitos del hospedante infectado. Entre estos productos de escisión, se destacará el fragmento C-terminal que tiene un peso molecular de 42 kDa (7, 8) que, a su vez, se escinde nuevamente en un fragmento N-terminal que tiene un peso molecular aparente convencional de 33 kDa y en un fragmento C-terminal que tiene un peso molecular aparente convencional de 19 kDa (9) que permanece fijado normalmente a la membrana del parásito al final de las modificaciones de las cuales es objeto, por medio de grupos del tipo glicosilfosfatidilinositol (GPI) (10, 11).

Se le vuelve a encontrar en el estado de anillo precoz del ciclo de desarrollo intraeritrocitario (15, 16), por lo cual se han realizado las observaciones de que este fragmento de 19 kDa podría desempeñar una función todavía no conocida, pero sin duda esencial en los procesos re-invasivos. De ello se desprenden las hipótesis ya formuladas en el pasado de que esta proteína podría constituir una diana particularmente eficaz para eventuales vacunas.

Se entenderá que las referencias realizadas frecuentemente en la continuación de la descripción a unas proteínas p42 y p19 procedentes de un cierto tipo de Plasmodium se extienden como refiriéndose a los productos de escisión C-terminales correspondientes de la proteína MSP-1 de este Plasmodium, o, por extensión, a unos productos que contienen sustancialmente las mismas secuencias en aminoácidos, obtenidos por recombinación genética o por síntesis química según las técnicas habituales, por ejemplo por síntesis de tipo "Applied System" o por sintetizador en fase sólida de tipo "Merrifield". Para más facilidad del lenguaje, las referencias a unas "p42 recombinantes" y a unas "p19 recombinantes" hacen referencia a unas "p42" y "p19" obtenidas mediante unas técnicas que comprenden por lo menos una etapa de ingeniería genética.

Frente a la dificultad de obtener cantidades importantes de parásitos para P. falciparum y la imposibilidad de cultivar P. vivax in vivo, ha resultado evidente que el único medio para producir una vacuna antipalúdica necesita recurrir a las técnicas que permiten la utilización de los péptidos o de las proteínas recombinantes. Pero, la MSP-1 es muy difícil de producir entera debido a su gran tamaño, de aproximadamente 200 kDa, un hecho que ha conducido a los investigadores a interesarse en la parte C-terminal cuya función, todavía desconocida, es probablemente la más importante.

A título de las proteínas recombinantes que se refieren a la parte C-terminal de MSP-1 de P. falciparum, que han sido producidas y ensayadas en el mono (12, 40, 41) se mencionarán:

Una composición que contiene la proteína de fusión p19 con una glutatión-S-transferasa producida en E. coli en asociación con alumbre o liposomas no ejerció ningún efecto protector sobre ninguno de los seis monos Aotus nancymai vacunados (40).

Una composición que contiene la proteína de fusión p42 con una glutatión-S-transferasa producida en E. coli en asociación con un adyuvante completo de Freund no ejerció ningún efecto protector en los dos tipos de monos Aotus (A. nancymai y A. vociferans) a los que fue administrada. La proteína p19 producida en S. cerevisiae ejerció un efecto protector en dos monos Aotus de tipo A. nancymai (12). Por el contrario, no ejerció ningún efecto protector en dos monos Aotus de tipo A. vociferans.

Algunos investigadores (Chang et al.) han referido asimismo unos ensayos de inmunización realizados en el conejo con una proteína recombinante p42 producida en un sistema baculovirus y que contiene una secuencia de aminoácidos en común con P. falciparum (18). De esta manera, estos autores indican que esta p42 recombinante se comporta en el conejo de forma sustancialmente igual que la proteína MSP-1 recombinante entera (gp 195). Esta proteína p42 en asociación con un adyuvante completo de Freund fue objeto de un ensayo de vacunación en un primate no humano susceptible a la infección por P. falciparum, Aotus, Lemurinus grisemembra (40). Los resultados muestran que 2 de 3 animales estaban completamente protegidos y el tercero, a pesar de mostrar una parasitemia parecida a los controles, tenía un periodo latente más largo. Sin embargo, es arriesgado concluir en el carácter protector en el ser humano de los anticuerpos así inducidos en contra de los parásitos en sí. Se recuerda en efecto, que no existe actualmente ningún modelo experimental muy satisfactorio en el primate para P. vivax y P. falciparum. El modelo Saimiri, que fue desarrollado para P. falciparum y P. vivax, y el modelo Aotus para P. falciparum, son unos sistemas artificiales que necesitan la adaptación de cepas de parásito y frecuentemente la esplenectomía de los animales para obtener unas parasitemias significativas. En consecuencia, los resultados de vacunación que proceden de estos modelos sólo pueden tener un valor predictivo limitado para el ser humano.

De todas formas se puede preguntar sobre lo que sería un porcentaje real de vacunación susceptible de ser obtenido eventualmente con dichas proteínas recombinantes, debido a la constatación -referida más adelante- que se realizó de la presencia en las p42 procedentes de los Plasmodium de la misma especie, y más particularmente en las p33 correspondientes, de regiones hipervariables que harían aleatoria en numerosos casos la eficacia inmunoprotectora de los anticuerpos inducidos en unas personas vacunadas por una p42 procedente de una cepa de Plasmodium en contra de una infección por otras cepas de la misma especie (13).

Se puede suponer asimismo que el polimorfismo importante de la parte N-terminal de la p42 desempeña una función significativa en la evasión inmunitaria, frecuentemente observada para este tipo de parásitos.

La presente invención tiene por objeto la producción de proteínas recombinantes que evitan estas dificultades, cuyo efecto protector se puede verificar en los modelos experimentales realmente significativos, o incluso directamente en el ser humano.

La presente invención se refiere más particularmente a las composiciones vacunantes contra un parásito del tipo Plasmodium infeccioso para el ser humano, que contiene a título de principio activo una proteína recombinante gicosilada o no, cuya secuencia polipeptídica constitutiva esencial es: