PROCESO DE FERMENTACION PARA LA PREPARACION DE L-AMINOACIDOS UTILIZANDO CEPAS DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAS.

Proceso de fermentación para la preparación de L-aminoácidos, en donde se llevan a cabo los pasos siguientes:



a) fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado, en cuyos microorganismos al menos el gen pckA o secuencias de nucleótidos que codifican el producto del gen pckA están atenuados,

b) enriquecimiento del L-aminoácido en el medio o en las células bacterianas, y

c) tratamiento del L-aminoácido, o d) constituyentes del caldo de fermentación y aislamiento de la biomasa en su totalidad o porciones de la misma como un producto sólido junto con el L-aminoácido

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP01/10209.

Solicitante: DEGUSSA AG.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: BENNIGSENPLATZ 1,40474 DUSSELDORF.

Inventor/es: RIEPING, MECHTHILD, HERMANN, THOMAS, THIERBACH, GEORG, BASTUCK,CHRISTINE.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 4 de Noviembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/52 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican enzimas o proenzimas.
  • C12P13/06 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Alanina; Leucina; Isoleucina; Serina; Homoserina.
  • C12P13/08 C12P 13/00 […] › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.
  • C12R1/19 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Escherichia coli.

Clasificación PCT:

  • C12N1/21 C12N […] › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12N15/60 C12N 15/00 […] › Liasas (4).
  • C12P13/04 C12P 13/00 […] › alfa- o beta-Aminoácidos.
  • C12P13/08 C12P 13/00 […] › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.

Clasificación antigua:

  • C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12N15/60 C12N 15/00 […] › Liasas (4).
  • C12P13/04 C12P 13/00 […] › alfa- o beta-Aminoácidos.
  • C12P13/08 C12P 13/00 […] › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.

Fragmento de la descripción:

Proceso de fermentación para la preparación de L-aminoácidos utilizando cepas de la familia enterobacteriáceas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso de fermentación para la preparación de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, utilizando cepas de la familia Enterobacteriáceas en las cuales al menos el gen pckA está atenuado.

Técnica anterior

Los L-aminoácidos se utilizan en nutrición animal, en medicina humana y en la industria farmacéutica.

Se conoce el modo de preparar L-aminoácidos por la fermentación de cepas de Enterobacteriáceas, especialmente Escherichia coli y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, están realizándose continuamente intentos para mejorar los procesos de preparación. Las mejoras de los procesos pueden referirse a medidas que implican la tecnología de la fermentación, v.g. alimentación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutrientes, v.g. la concentración de azúcar durante la fermentación, o el acabado de la forma del producto, v.g. por cromatografía de intercambio iónico, o las características intrínsecas de productividad del microorganismo propiamente dicho.

Las características de productividad de estos micro-organismos se mejoran utilizando métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes para dar cepas que son resistentes a antimetabolitos, v.g. el análogo de treonina ácido a-amino-ß-hidroxivalérico (AHV) o auxótrofos para metabolitos de importancia reguladora, y producir L-aminoácidos, v.g. L-treonina.

Métodos de la tecnología del DNA recombinante han sido utilizados también desde hace algunos años para mejorar las cepas productoras de L-aminoácidos de la familia Enterobacteriáceas por amplificación de genes de biosíntesis individuales de aminoácidos y estudio del efecto sobre la producción.

EP-A-1094111 proporciona un proceso para la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en particular L-lisina y L-treonina, utilizando materias corineformes que producen ya en particular L-aminoácidos y en las cuales la o las secuencias de nucleótidos que codifica(n) el producto del gen pck están atenuadas.

Prost Jean-Francois et al.: Detection of an extended - 10 element in the prometer región of the pckA gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase in Escherichia Coli. Biochemie 81: 197-200 (1999), describen que la regulación de la transcripción del gen pckA que codifica fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa en Escherichia coli se analizó por mutagénesis orientada de la región promotora y medida de la iniciación de la transcripción in vitro.

Kramer R: Genetic and physiological approaches for the production of amino acids Journal of Biotechnology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, NL, vol. 45, no. 1, 12 de febrero (1996-02-12), páginas 1-21, XP004036833 ISSN: 0168-1656, describe los caminos relevantes en microorganismos biotecnológicamente relevantes productores de aminoácidos.

Database Biosis [Online] Biosciences Information Service, Philadelphia, PA, EE.UU.: 1990, Medina V. et al. proporciona Sequence of the pck - a gene of Escherichia Coli K-12 Relevance to genetic and allosteric regulation and Homology of Escherichia Coli Phospho-enolpiruvate Carboxykinase with the enzymes from Trypanosorna-Brucei and Saccharomyces-Cerevisiae No. de Acceso PREVI99191038347 a la Base de Datos XP002193203.

En Database Biosis [On line] Biosciences Information Service, Philadelphia, PA, EE.UU.; 1990, puede encontrarse Goldie H. et al.: Physical and Genetic Locus from Escherichia coli K12 No. de Acceso PREV 199089092769 a la Base de Datos XP002193202.

Objeto de la invención

El objeto que se propusieron a sí mismos los inventores fue proporcionar nuevos procedimientos para mejorar la preparación de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, por fermentación.

Sumario de la invención

La invención proporciona un proceso de fermentación para la preparación de L-aminoácidos, especialmente L-treonina, utilizando microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que, en particular, producen ya L-treonina y en los cuales la secuencia de nucleótidos (gen pckA) que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (PEP-carboxiquinasa) (EC 4.1.1.49) está atenuada.

Descripción detallada de la invención

En los casos en que se mencionan L-aminoácidos o aminoácidos en adelante, esto significa uno o más amino-ácidos, con inclusión de sus sales, seleccionados del grupo constituido por L-asparagina, L-treonina, L-serina, L-glutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptófano, L-homoserina y L-arginina. Se prefiere particularmente L-treonina.

En este contexto, el término atenuación describe la reducción o desactivación, en un microorganismo, de la actividad intracelular de una o más enzimas (proteínas) que son codificadas por el DNA apropiado, por ejemplo por utilización de un promotor débil o un gen o alelo que codifica una enzima apropiada con actividad baja, o desactivación de la enzima (proteína) apropiada, y opcionalmente combinación de estas medidas.

Por medidas de atenuación, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se reduce en general hasta 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje o de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.

El proceso se caracteriza porque se llevan a cabo los pasos siguientes:

a) fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas productores del L-aminoácido deseado, en cuyos microorganismos está atenuado al menos el gen pckA o secuencias de nucleótidos que codifican el producto del gen pckA;
b) enriquecimiento del L-aminoácido en el medio o en las células bacterianas, y
c) aislamiento del L-aminoácido o
d) aislamiento de constituyentes del caldo de fermentación y la biomasa en su totalidad o porciones de la misma como un producto sólido junto con el L-aminoácido.

Los microorganismos proporcionados por la presente invención pueden producir L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón u opcionalmente celulosa, o a partir de glicerol y etanol. Dichos microorganismos son representativos de la familia Enterobacteriáceas seleccionados de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros Escherichia y Serratia. Las especies Escherichia coli y Serratia marcescens pueden mencionarse en particular entre los géneros Escherichia y Serratia respectivamente.

Ejemplos de cepas adecuadas, particularmente cepas productoras de L-treonina, del género Escherichia, expresamente de la especie Escherichia coli son:

Ejemplos de cepas productoras de L-treonina del género Serratia, especialmente de la especie Serratia marcescens, son:

Las cepas productoras de L-treonina de la familia Enterobacteriáceas poseen preferiblemente, entre otras cosas, una o más características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo que comprende resistencia al ácido a-amino-ß-hidroxivalérico, resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a a-metilserina, resistencia a ácido diaminosuccínico, resistencia a ácido a-aminobutírico, resistencia a borrelidina, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales como hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina tales como 6-dimetilaminopurina, necesidad de L-metionina, necesidad opcionalmente parcial y compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a L-homoserina, L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia a ácido glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad a fluoropiruvato, insuficiencia de treonina-deshidrogenasa, capacidad opcional para utilización de sacarosa, amplificación del operón treonina, amplificación de la homoserina-deshidrogenasa-I-aspartato-quinasa-I,...

 


Reivindicaciones:

1. Proceso de fermentación para la preparación de L-aminoácidos, en donde se llevan a cabo los pasos siguientes:

a) fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado, en cuyos microorganismos al menos el gen pckA o secuencias de nucleótidos que codifican el producto del gen pckA están atenuados,
b) enriquecimiento del L-aminoácido en el medio o en las células bacterianas, y
c) tratamiento del L-aminoácido, o d) constituyentes del caldo de fermentación y aislamiento de la biomasa en su totalidad o porciones de la misma como un producto sólido junto con el L-aminoácido.

2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se utilizan microorganismos en los cuales otros genes del camino biosintético del L-aminoácido deseado se amplifican adicionalmente.

3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se utilizan microorganismos en los cuales los caminos metabólicos que reducen la formación del L-aminoácido deseado se desactivan al menos parcialmente.

4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la expresión del o de los polinucleótidos que codifican el producto del gen pckA está desactivada.

5. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las propiedades reguladoras y/o catalíticas del polipéptido (proteína enzimática) codificado por el polinucleótido pckA están reducidas.

6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde microorganismos de la familia Enterobacteriáceas se fermentan, en los cuales uno o más genes seleccionados del grupo que comprende:

6.1 el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
6.2 el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa,
6.3 el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa,
6.4 el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato-carboxilasa,
6.5 los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,
6.6 el gen rhtB para resistencia a homoserina, y
6.7 el gen rhtC para resistencia a treonina,
6.8 el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa se amplifican simultáneamente.

7. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales uno o más genes seleccionados del grupo que comprende:

7.1 el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
7.2 el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
7.3 el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA, y
7.4 el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP,
se atenúan, o se reduce la expresión de los mismos.

8. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se prepara L-isoleucina, L-valina, L-lisina o L-treonina.

9. El plásmido pMAK705?pckA, que contiene partes de las regiones 5' y 3' del gen pckA, correspondientes a SEQ ID No. 3.

10. Polinucleótido aislado de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que contienen una secuencia de polinucleótidos que codifica las regiones 5' y 3' del gen pckA, representadas en SEQ ID No. 4, que es particularmente adecuado como constituyente de plásmidos para la mutagénesis específica de posición del gen pckA.

11. Cepas productoras de L-treonina de la familia Enterobacteriáceas que contienen una mutación de deleción en el gen pckA, correspondiente a SEQ ID No. 4.

12. Cepas productoras de L-treonina de la familia Enterobacteriáceas de acuerdo con la reivindicación 11, que contienen adicionalmente una mutación de deleción en el marco de lectura abierto ytfP, correspondiente a SEQ ID No. 6 ó 7.

13. Cepas productoras de L-treonina de la familia Enterobacteriáceas de acuerdo con la reivindicación 11, que contienen adicionalmente una mutación de deleción en el marco de lectura abierto yjfA, correspondiente a SEQ ID No. 6 ó 7.

14. Cepas productoras de L-treonina de la familia Enterobacteriáceas de acuerdo con la reivindicación 11, en donde las mismas tienen una o más características seleccionadas del grupo que comprende: resistencia a ácido a-amino-ß-hidroxivalérico, homoserina-deshidrogenasa I-aspartato-quinasa I amplificada en la forma resistente a la realimentación, necesidad parcial opcionalmente compensable de L-isoleucina, treonina-deshidrogenasa atenuada y capacidad para utilizar sacarosa.

15. La cepa MG442?pckA de Escherichia coli K-12, depositada bajo el número DSM 13761 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células).

16. La cepa B3996kur?tdhpckA/pVIC40 de Escherichia coli K12, depositada bajo el número DSM 14150 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células).


 

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