PROCESO PARA LA PREPARACION POR FERMENTACION DE L-AMINOACIDOS UTILIZANDO CEPAS DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAS.

Un proceso para la preparación por fermentación de L-treonina,

L-valina o L-lisina, que comprende la realización de los pasos siguientes:

a)fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado y en los cuales al menos el gen poxB o secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico están atenuadas, en particular eliminadas,

b)concentración del L-aminoácido correspondiente en el medio o en las células de las bacterias y

c)aislamiento del L-aminoácido

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP01/11228.

Solicitante: DEGUSSA AG.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: BENNIGSEPLATZ 1,40474 DUSSELDORF.

Inventor/es: RIEPING, MECHTHILD, THIERBACH, GEORG.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 21 de Abril de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N9/02B
  • C12P13/08 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.

Clasificación PCT:

  • C12N15/53 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Oxidorreductasas (1).

Clasificación antigua:

  • C12P13/00 C12P […] › Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno.

Fragmento de la descripción:

Proceso para la preparación por fermentación de L-aminoácidos utilizando cepas de la familia enterobacteriáceas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un proceso para la preparación por fermentación de L-treonina, L-lisina y L-valina utilizando cepas de la familia Enterobacteriáceas en las cuales el gen poxB está atenuado.

Técnica anterior

Los L-aminoácidos, en particular L-treonina, L-lisina y L-valina se utilizan en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy particularmente en nutrición animal.

Se conoce el modo de preparar L-aminoácidos por fermentación de cepas de Enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, está trabajándose constantemente para mejorar los procesos de preparación. Las mejoras de los procesos pueden referirse a las medidas de fermentación, tales como v.g. agitación y suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutrientes, v.g. la concentración de azúcar durante la fermentación, o el acabado de la forma del producto, v.g. por cromatografía de reemplazamiento iónico, o las características intrínsecas de productividad del microorganismo propiamente dicho.

Para mejorar las propiedades de productividad de estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes a antimetabolitos, tales como v.g. el análogo de treonina ácido a-amino-ß-hidroxivalérico (AHV), o son auxótrofas para metabolitos de importancia reguladora y producen L-aminoácido, tal como v.g. L-treonina.

Se han utilizado también desde hace algunos años métodos de la técnica del DNA recombinante para mejorar el linaje de cepas de la familia Enterobacteriáceas productoras de L-aminoácidos por amplificación de genes individuales de biosíntesis de aminoácidos e investigación del efecto sobre la producción.

Objeto de la invención

El objeto que se propusieron los inventores fue proporcionar nuevas medidas para la preparación mejorada por fermentación de L-treonina, L-lisina y L-valina.

Descripción de la invención

La invención proporciona un proceso para la preparación por fermentación de L-treonina, utilizando organismos de la familia Enterobacteriáceas que, en particular, producen ya L-treonina y en los cuales la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima piruvato-oxidasa (EC 1.2.2.2) (gen poxB) está atenuada.

En este contexto, el término "atenuación" describe la reducción o eliminación, en un microorganismo, de la actividad intracelular de una o más enzimas (proteínas) que son codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo por utilización de un promotor débil o un gen o alelo que codifica una enzima correspondiente con actividad baja, o elimina la enzima (proteína) o el gen correspondiente, y opcionalmente combinación de estas medidas.

El proceso comprende la realización de los pasos siguientes:

a) fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales está atenuado al menos el gen poxB,
b) concentración del L-aminoácido correspondiente en el medio o en las células de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, y
c) aislamiento del L-aminoácido deseado.

Los microorganismos proporcionados por la presente invención pueden producir L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa, o a partir de glicerol y etanol. Dichos microorganismos son representativos de la familia Enterobacteriáceas seleccionados de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros Escherichia y Serratia. Del género Escherichia puede mencionarse en particular la especie Escherichia coli, y del género Serratia la especie Serratia marcescens, respectivamente.

Cepas adecuadas del género Escherichia, que producen en particular L-treonina, particularmente de la especie Escherichia coli, son, por ejemplo:

Cepas adecuadas productoras de L-treonina del género Serratia, en particular de la especie Serratia marcescens, son, por ejemplo:

Las cepas productoras de L-treonina de la familia Enterobacteriáceas poseen preferiblemente, entre otras cosas, una o más características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo que comprende resistencia al ácido a-amino-ß-hidroxivalérico, resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a a-metilserina, resistencia a ácido diaminosuccínico, resistencia a ácido a-aminobutírico, resistencia a borrelidina, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina tales como 6-dimetilaminopurina, necesidad de L-metionina, necesidad opcionalmente parcial y compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a L-homoserina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia a ácido glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad a fluoropiruvato, insuficiencia de treonina-deshidrogenasa, capacidad opcional para utilización de sacarosa, amplificación del operón treonina, amplificación de la homoserina-deshidrogenasa-I-aspartato-quinasa-I, preferiblemente de la forma resistente a la realimentación, amplificación de homoserina-quinasa, amplificación de treonina-sintasa, amplificación de aspartato-quinasa, opcionalmente de la forma resistente a la realimentación, amplificación de aspartato-semialdehido-deshidrogenasa, amplificación de fosfoenolpiruvato-carboxilasa, opcionalmente de la forma resistente a la realimentación, amplificación de fosfoenol-piruvato-sintasa, amplificación de transhidrogenasa, amplificación del producto del gen RhtB, amplificación del producto del gen RhtC, amplificación del producto del gen YfiK, amplificación de una piruvato-carboxilasa, y atenuación de la formación de ácido acético.

Se ha encontrado que microorganismos de la familia Enterobacteriáceas producen L-aminoácidos, particularmente L-treonina, de manera mejorada después de atenuación, en particular eliminación del gen poxB, que codifica piruvato-oxidasa (EC 1.2.2.2).

Adicionalmente, se ha encontrado que los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas forman concentraciones menores del subproducto indeseable ácido acético después de atenuación, en particular eliminación, del gen poxB, que codifica piruvato-oxidasa (número EC 1.2.2.2).

La secuencia de nucleótidos del gen poxB de Escherichia coli ha sido publicada por Grabau y Cronan (Nucleic Acids Research, 14 (13), 5449-5460 (1986)) y puede tomarse también de la secuencia del genoma de Escherichia coli publicada por Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997), bajo el Número de Acceso AE000188. La secuencia de nucleótidos del gen poxB de Escherichia coli se representa en SEQ ID No. 1 y la secuencia de aminoácidos del producto del gen asociado se representa en SEQ ID No. 2.

Los genes poxB descritos en las referencias de textos anteriores pueden utilizarse de acuerdo con la invención. Adicionalmente, pueden utilizarse alelos del gen poxB que son resultado de la degeneración del código genético o de "mutaciones sentido" de función neutra.

Para conseguir una atenuación, por ejemplo, puede reducirse o eliminarse la expresión del gen poxB o las propiedades catalíticas de la proteína enzimática. Ambas medidas pueden combinarse opcionalmente.

La reducción de la expresión génica puede conseguirse por cultivo adecuado, por modificación genética (mutación) de las estructuras de señal de la expresión génica, o también por la técnica del DNA antisentido. Ejemplos de estructuras de señal de la expresión génica son genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de fijación de ribosoma, el codón inicial y terminadores. Los expertos en la técnica encontrarán información a este respecto entre otros lugares en, v.g. Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering...

 


Reivindicaciones:

1. Un proceso para la preparación por fermentación de L-treonina, L-valina o L-lisina, que comprende la realización de los pasos siguientes:

a)fermentación de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado y en los cuales al menos el gen poxB o secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico están atenuadas, en particular eliminadas, b)concentración del L-aminoácido correspondiente en el medio o en las células de las bacterias y c)aislamiento del L-aminoácido.

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende emplear microorganismos en los cuales otros genes del camino de biosíntesis del L-aminoácido deseado se amplifican adicionalmente.

3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende emplear microorganismos en los cuales los caminos metabólicos que reducen la formación del L-aminoácido deseado se eliminan al menos parcialmente.

4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende atenuar, en particular eliminar, la expresión del o de los polinucleótidos que codifica(n) el producto del gen poxB.

5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende reducir las propiedades reguladoras y/o catalíticas del polipéptido (proteína enzimática) codificado por el polinucleótido poxB.

6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende fermentar, para la preparación de L-treonina, microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales uno o más genes seleccionados del grupo constituido por:

6.1el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa, 6.2el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa, 6.3el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa, 6.4el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato-carboxilasa, 6.5los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa, 6.6el gen rhtB que imparte resistencia a homoserina, 6.7el gen mqo que codifica resistencia a malato:quinona-oxidorreductasa, 6.8el gen rhtC para resistencia a treonina, 6.9el gen thrE que codifica exportación de treonina y 6.10el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa

se intensifica(n), en particular se sobreexpresan, simultáneamente.

7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende fermentar, para la preparación de L-treonina, microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los cuales uno o más genes seleccionados del grupo constituido por:

7.1el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa, 7.2el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa, 7.3el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA, 7.4el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP, y 7.5el gen pckA que codifica la enzima fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa

se atenúan, en particular se eliminan, o se reduce la expresión de los mismos, simultáneamente.

8. Un microorganismo de la familia Enterobacteriáceas que produce L-treonina, en el cual el gen poxB o secuencias de nucleótidos que codifican su producto génico están atenuados, en particular eliminados, y que tienen una resistencia al ácido a-amino-ß-hidroxivalérico y opcionalmente una necesidad parcial compensable de L-isoleucina.

9. La cepa MG442?poxB de Escherichia coli K-12, depositada bajo el número DSM 13762 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células, Braunschweig, Alemania).

10. Un polinucleótido aislado de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, que contiene la secuencia polinucleotídica de SEQ ID No. 4, adecuado en particular como constituyente de plásmidos para la mutagénesis específica de posición del gen poxB.

11. Una cepa de la familia Enterobacteriáceas que produce L-treonina y contiene SEQ ID No. 4.


 

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