Procedimiento quimioenzimático para la preparación de un iminociclitol de fórmula (I), (II), (III) ó (IV):

Procedimiento quimioenzimático para la preparación de iminociclitoles.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento quimioenzimático para la preparación de iminociclitoles. Los productos sintetizados se pueden usar como complementos dietéticos e ingredientes funcionales en la industria alimenticia, así como agentes terapéuticos (p. ej., en el tratamiento de diabetes).

Estado de la técnica

Los compuestos polihidroxilados, tales como oligosacáridos, carbohidratos complejos y sus conjugados con lípidos y proteínas, son moléculas de gran importancia en procesos bioquímicos de reconocimiento biológico tales como adhesión celular, infecciones virales, diferenciación celular en el desarrollo de órganos y metástasis (Koeller, K. M., Wong, C. H., Nat. Biotechnol. 18 (2000) 835). En consecuencia, las enzimas implicadas en su síntesis o degradación, glicosiltransferasas y glicosidasas, respectivamente, constituyen dianas de inhibición o de activación (según Kolter, T., Wendeler, M., Chembiochem 4 (2003) 260) dada su implicación en alteraciones metabólicas y en enfermedades tales como diabetes tipo II, hepatitis B y C, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, fibrosis cística, cáncer de colon o infecciones virales incluido el VIH (Asano, N., J. Enzyme Inhib. 15 (2000) 215; Asano, N., Glycobiology 13 (2003) 93R; Fiaux, H., Popowycz, F., Favre, S., Schutz, C., Vogel, P., Gerber-Lemaire, S., Juillerat-Jeanneret, L., J. Med. Chem. 48 (2005) 4237).

De entre los compuestos polihidroxilados inhibidores de glicosiltransferasas y glicosidasas destacan los iminociclitoles tipo pirrolidinas, piperidinas, indolizidinas, pirrolizidinas, nortropanos e iminociclitoles polihidroxilados de siete miembros, entre otros, algunos de los cuales son potentes inhibidores de glicosidasas y glicosiltransferasas (Asano, N., J. Enzyme Inhib. 15 (2000) 215; Asano, N., Glycobiology 13 (2003) 93R; Lillelund, V. H., Jensen, H. H., Liang, X., Bols, M., Chem. Rev. 102 (2002) 515; Compain, P., Martin, O. R., Curr. Top. Med. Chem. 3 (2003) 541; Mehta, G., Lakshminath, S., Tetrahedron Lett. 43 (2002) 331; Moris-Varas, F., Qian, X.-H., Wong, C.-H., J. Am. Chem. Soc. 118 (1996) 7647; Fuentes, J., Olano, D., Pradera, M. A., Tetrahedron Lett. 40 (1999) 4063; Li, H. Q., Bleriot, Y., Chantereau, C., Mallet, J. M., Sollogoub, M., Zhang, Y. M., Rodriguez-García, E., Vogel, P., Jimenez Barbero, J., Sinay, P., Org. Biomol. Chem. 2 (2004) 1492; Lin, C. C., Pan, Y. S., Patkar, L. N., Lin, H. M., Tzou, D. L. M., Subramanian, T., Bioorg. Med. Chem. 12 (2004) 3259; Godin, G., Garnier, E., Compain, P., Martin, O. R., Ikeda, K., Asano, N., Tetrahedron Lett. 45 (2004) 579).

Algunos derivados como el miglitol y el miglustat son fármacos que se comercializan para el tratamiento de la diabetes tipo II (Platt, F. M., Butters, T. D., Drugs 63 (2003) 2435).

Se han descrito algunos iminociclitoles naturales o extractos vegetales que contienen iminociclitoles como ingredientes funcionales en la industria alimenticia o como complementos dietéticos. Así, US20010018090 describe el uso de la 1-deoxinojirimicina o un análogo de la misma como agente reductor de calorías que se puede incorporar a un alimento o bebida; US20060222720 describe un agente anoréctico que contiene, como ingredientes activos, extractos de disolvente acuosos de Vernonia cinerea y moras; WO2004037001 describe la adición de extractos de moras a un alimento que contiene sacáridos para regular los niveles de azúcar en sangre.

Las estrategias quimio-enzimáticas descritas hasta el momento para la síntesis de iminociclitoles se basan en la utilización de aldolasas, enzimas capaces de catalizar reacciones de condensación aldólica estereoselectivas entre aldehidos y cetonas (Von der Osten, C. H., Sinskey, A. J., Barbas, C. F., III, Pederson, R. L.,Wang, Y. F.,Wong, C. H., J. Am. Chem. Soc. 111 (1989) 3924,Romero, A., Wong, C. H., J. Org. Chem. 65 (2000) 8264,Look, G. C., Fotsch, C. H., Wong, C. H., Acc. Chem. Res. 26 (1993) 182,Machajewski, T. D., Wong, C. H., Angew. Chem. Int. Ed. 39 (2000) 1353; Patente (US005329052A)). De entre las aldolasas conocidas, las dependientes de la dihidroxiacetona fosfato (DHAP) han centrado la atención por cuatro razones:

Las aldolasas dependientes de DHAP (DHAP aldolasas) catalizan la adición aldólica reversible de DHAP a un aldehido aceptor, generándose a,ß-dihidroxicetonas con dos nuevos centros estereogénicos. Particularmente interesante es que se conocen las cuatro DHAP aldolasas estereocomplementarias (Figura 1): D-fructosa-1,6-difosfato aldolasa (FruA), L-rhamnulosa-1-fosfato aldolasa (RhuA); L-fuculosa-1-fosfato aldolasa (FucA) y D-tagatosa-1,6-difosfato aldolasa (TagA). Ventajosamente, estos biocatalizadores tienen cierta capacidad de controlar la estereoquímica de la adición aldólica, dependiendo la configuración de los nuevos centros estereogénicos creados de la enzima y no de los reactivos de la adición aldólica.

El esquema sintético quimio-enzimático general para la síntesis de iminociclitoles empleando DHAP-aldolasas se muestra en la Figura 2. El paso crucial en este esquema es la adición aldólica de la DHAP a aminoaldehidos o sus equivalentes sintéticos catalizada por DHAP aldolasas. En esta etapa se generan dos centros estereogénicos cuya configuración depende de la enzima, aunque existen numerosos ejemplos en los que, en función del sustrato, la enzima pierde selectividad generándose productos diastereoméricos. La siguiente etapa es la hidrólisis de la porción fosfato del aducto aldol mediante una fosfatasa ácida. Finalmente, la eliminación de Cbz y la transformación al iminociclitol se realiza generalmente en una etapa.

Una etapa crucial en esta síntesis es la preparación de la dihidroxiacetona fosfato (DHAP). La síntesis química de la dihidroxiacetona fosfato se realiza en cinco etapas con rendimientos globales alrededor del 60% (Figura 3) según lo descrito por Jung et al. (Jung, S.-H., Jeong, J.-H., Miller, P., Wong, C.-H., J. Org. Chem. 59 (1994) 7182).

Una aproximación alternativa son los sistemas multienzimáticos para la generación "in situ" de DHAP. Se trata de procedimientos sofisticados que exigen un control muy estricto de las condiciones de reacción y la presencia en la mezcla de reacción de componentes que pueden dificultar el aislamiento y purificación del producto final (Fessner, W. D., Sinerius, G., Angew. Chem. Int. Ed. 33 (1994) 209; Charmantray, F., El Blidi, L., Gefflaut, T., Hecquet, L.,Bolte, J., Lemaire, M., J. Org. Chem. 69 (2004) 9310,Sanchez-Moreno, I., Francisco García-García, J., Bastida, A., García-Junceda, E., Chem. Commun. (2004) 1634).

En la patente (US005329052A) y como se describe en Von der Osten et al. (Von der Osten, C. H., Sinskey, A. J., Barbas, C. F., III, Pederson, R. L., Wang, Y. F., Wong, C. H., J. Am. Chem. Soc. 111 (1989) 3924), se utiliza dihidroxiacetona en presencia de sales de arsénico como sustituto de la DHAP para la adición aldólica enzimática. Si bien se simplifica el procedimiento, la utilización de sales de arsénico no es aplicable debido a su toxicidad y, por tanto, su peligrosidad para la salud y el medio ambiente.

Las síntesis quimioenzimáticas de iminociclitoles descritas hasta el momento emplean alrededor de 8 etapas a partir del aldehido aceptor: dos de ellas enzimáticas, adición aldólica de DHAP a aldehido e hidrólisis del éster fosfato; y 6 etapas químicas para la síntesis de DHAP y la formación de los correspondientes iminociclitoles. Si la reacción se realiza con sistemas multienzimáticos, ésta requiere de dos enzimas más: una para la formación del intermedio clave, DHAP, y otra para regenerar el reactivo de fosforilación enzimática. Por tanto son estrategias de muchos pasos o muy sofisticadas y, por tanto, de limitada aplicación industrial.

Resumen de la invención

Un objeto de la invención es un procedimiento quimioenzimático para la preparación de un iminociclitol de fórmula (I), (II), (III) o (IV):

 

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Reivindicaciones:

1. Procedimiento quimioenzimático para la preparación de un iminociclitol de fórmula (I), (II), (III) ó (IV):

donde:

- R¹ y R² son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: H, OH, hidroximetil, metil, etil, butil, pentil, hexil, octil, isopropil, isobutil, 2-metilbutil, y bencil;
- R³ se selecciona del grupo que consiste en: H, hidroximetil, hidroxietil, etil, butil, pentil, hexil, octil, dodecil, isobutil, isopropil, isopentil, 2-metilbutil, bencil, y feniletil;
- n: 0 ó 1;
- las configuraciones de los átomos de carbono a los que se unen los sustituyentes R¹ y R² en el iminociclitol de fórmula I son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de R y S; y
- los centros estereogénicos (*) en el iminociclitol de fórmula II, III ó IV son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de R y S,

caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

i) adición aldólica entre la dihidroxiacetona (DHA) y un aminoaldehido aceptor, catalizada por una enzima D-fructosa-6-fosfato aldolasa, el aminoaldehido siendo de fórmula V, VI ó VII,

donde:

- R¹, R² y n son según se definen más arriba,
- las configuraciones de los átomos de carbono a los que se unen los sustituyentes R¹ y R² en la fórmula V y el centro estereogénico de las fórmulas VI y VII son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de R y S, y
- Cbz representa un grupo benciloxicarbonil;

y

ii) una aminación reductora intramolecular del aducto de adición obtenido en la etapa i) con H₂, en presencia de un catalizador metálico; llevándose a cabo dicha etapa (ii), opcionalmente, con un aldehido de fórmula R³-CHO, donde R³ es según se define más arriba, lo que resulta en una aminación reductora doble.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el iminociclitol se selecciona del grupo que consiste en: miglitol; miglustat; D-fagomina; 1-deoxinojirimicina; N-butyl-D-fagomina; y 1,4-dideoxi-1,4-imino-D-arabinitol.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el iminociclitol se selecciona del grupo que consiste en: D-fagomina; 1-deoxinojirimicina; N-butyl-D-fagomina; y 1,4-dideoxi-1,4-imino-D-arabinitol.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el iminociclitol se selecciona del grupo que consiste en: D-fagomina; 1-deoxinojirimicina; y N-butyl-D-fagomina.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el aminoaldehido en i) es un aminoaldehido protegido tipo V seleccionado del grupo que consiste en: N-Cbz-3-aminopropanal, y (S)-N-Cbz-3-amino-2-hidroxipropanal.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el catalizador metálico utilizado en la etapa ii) se selecciona del grupo que consiste en: Pd, Pt, Rh y combinaciones de Pd y cianoborohidruro sódico (NaCNBH₃).

7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima FSA tiene un grado de identidad con SEC ID NO: 2 de al menos el 85%.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la enzima FSA tiene un grado de identidad con SEC ID NO: 2 de al menos el 95%.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la enzima FSA consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 2.

 

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