Un procedimiento para formar un polímero funcionalizado, que comprende

(a)proporcionar un polímero no peptídico y soluble en agua que comprende dos grupos hidroxilo;

(b)hacer reaccionar el polímero no peptídico y soluble en agua que comprende dos grupos hidroxilo en una o más etapas de reacción, con uno o más reactivos de funcionalización que son reactivos con un grupo hidroxilo para efectuar la introducción de un grupo funcional, Y, para formar una mezcla que comprende:

(i)el polímero no peptídico no sustituido y soluble en agua procedente de la etapa (a),

(ii)un polímero monosustituido que comprende un grupo Y único, y

(iii)un polímero disustituido que comprende dos grupos Y,

en condiciones eficaces para formar:

(i)entre 8 y 45 por ciento del polímero monosustituido; y

(ii)no más del 40 por ciento del polímero disustituido; y

(iii)una relación de polímero monosustituido a polímero disustituido que es de 2:1 a 40:1; y

(c)purificar la mezcla procedente de la etapa (b) para proporcionar un polímero monosustituido sustancialmente libre de las especies poliméricas no sustituidas y disustituidas

Procedimiento para preparar polímeros funcionalizados a partir de alcoholes poliméricos.

Campo de la invención

Entre otras cosas, esta invención se refiere a polímeros no peptídicos funcionalizados y solubles en agua, y en particular, a los procedimientos para preparar, purificar, y utilizar dichos polímeros.

La unión covalente del polímero hidrófilo, poli(etilenglicol), "PEG" de forma abreviada, a moléculas y superficies es de considerable utilidad en áreas tales como la biotecnología y la medicina. PEG es un polímero que posee muchas propiedades beneficiosas. Por ejemplo, PEG es soluble en agua y en muchos disolventes orgánicos, no es tóxico ni inmunógeno, y cuando se une a una superficie, PEG proporciona un recubrimiento biocompatible protector.

Las aplicaciones o usos comunes de PEG incluyen (i) enlace covalente con las proteínas, por ejemplo, para alargar la semivida en el plasma y reducir el aclaramiento a través del riñón, (ii) enlace covalente a moléculas pequeñas para mejorar la solubilidad en agua y facilitar la formulación, y para reducir la velocidad de aclaramiento del riñón, (iii) unión a superficies tales como en sustituciones arteriales, dispositivos en contacto con la sangre, y biosensores, (iv) como vehículo soluble para la síntesis de biopolímeros, y (v) como reactivo en la preparación de hidrogeles.

En muchos, si no en todos los usos señalados anteriormente, es necesario activar en primer lugar el PEG convirtiendo su extremo hidroxilo en un grupo funcional capaz de reaccionar fácilmente con un grupo funcional que se encuentre en una molécula o superficie diana deseada, tal como un grupo funcional que se encuentre en la superficie de una proteína. Para las proteínas, los aminoácidos reactivos típicos incluyen lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina, tirosina, el grupo amino N terminal y el ácido carboxílico C terminal.

El PEG usado como material de partida para la mayor parte de reacciones de activación del PEG es normalmente un PEG bloqueado en el extremo. Un PEG bloqueado en el extremo es un PEG en el que uno o más de los grupos hidroxilo, localizado normalmente en un extremo del polímero, se convierte en un grupo no reactivo, tal como un grupo metoxi, etoxi, o benciloxi. El más comúnmente usado es metoxiPEG, abreviado como mPEG. Se prefieren generalmente PEG bloqueados en el extremo tales como mPEG, debido a que dichos PEG bloqueados en el extremo son normalmente más resistentes a la reticulación y a la agregación. A continuación se muestran las estructuras de dos alcoholes PEG bloqueados en el extremo comúnmente empleados, mPEG y monobencil PEG (también denominado como bPEG).

en el que n oscila normalmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 2.000.

Aunque en muchos aspectos se prefiere el uso de mPEG, existen algunas graves desventajas asociadas con el uso de mPEG como material de partida. El mPEG comercialmente disponible está a menudo contaminado con PEG diol (HO-(CH₂CH₂)_n-OH), en el que los valores de n son normalmente como se ha indicado anteriormente. Aunque algunos fabricantes producen PEG con un bajo contenido en diol, sigue estando presente alguna impureza del diol, y el contenido puede variar tanto como un 10-15%, o en algunos casos, incluso más. El PEG diol surge de la presencia de cantidades traza de contaminación por agua durante la polimerización catalizada por base del óxido de etileno para formar mPEG. Debido a una concentración menor de iniciador de metóxido en la preparación de PEG de elevado peso molecular, excediendo, por ejemplo, de 20 kilodalton (K) o similar, la contaminación por agua, y por tanto, la formación de diol, pueden representar un problema más grave. Para PEG con elevado peso molecular, la contaminación de diol puede alcanzar o incluso exceder el 30%. Adicionalmente, debido a que la cadena de diol puede crecer en cada extremo, la contaminación de diol tiene normalmente un peso molecular promedio más elevado que el mPEG deseado.

Una característica de la química de PEGilación es que, en la mayor parte de los casos, no se eliminan el diol y el PEG difuncional o diactivado correspondiente resultantes del PEG diol. En dichos casos, el producto conjugado contendrá una cierta cantidad de producto reticulado, y posee adicionalmente una polidispersabilidad aumentada debido a los contaminantes del polímero de diol y derivados de diol. Esto es muy indeseable para un producto farmacéutico, debido a que la presencia y las cantidades de dichos contaminantes pueden ser muy variables, conduciendo de esta manera a la irreproducibilidad del producto.

Se han empleado hasta la fecha diferentes soluciones en un intento por superar estos problemas. En una solución para reducir la cantidad de impurezas de diol en los materiales de partida del mPEG, se han fabricado alcoholes PEG monofuncionales mediante la polimerización de óxido de etileno en condiciones estrictamente anhidras usando un iniciador de alcohol en forma de una sal de sodio o potasio (Odian, Principles of Polymerization, 3ª edición, Wiley, 1991; F. E. Bailey, Jr. & J. V. Koleske, in Poly(ethylene oxide), Academic Press, Nueva York, 1976). Aunque, dando como resultado mPEG que tienen algo reducido el contenido de diol, esta solución no se presta por sí misma a la síntesis a escala comercial, debido a la sensibilidad del procedimiento a la humedad y a los problemas asociados para controlar el peso molecular y la polidispersabilidad del producto. Más aún, el procedimiento es más bien complicado y caro de operar, especialmente para la fabricación de cantidades relativamente pequeñas de reactivos poliméricos de elevado peso molecular necesarios para muchas aplicaciones farmacéuticas. Además, la reactividad explosiva del monómero requiere precauciones de seguridad adicionales que se añaden al coste de fabricación.

En otra solución para erradicar la contaminación de diol, se metiló benciloxi PEG que contenía impurezas de diol y a continuación se hidrogenó para eliminar el grupo bencilo (Véase la Patente de los Estados Unidos Nº 6.448.369) Como resultado, el PEG diol presente en la composición se convirtió en el dimetil éter inerte. Sin embargo, este procedimiento puede ser desventajoso en diversos aspectos En primer lugar, esta solución se añade al número total de etapas sintéticas que se deben llevar a cabo para preparar un reactivo o producto final de PEG activado. En segundo lugar, aunque inerte, esta solución conduce todavía a la formación de una impureza en la composición de PEG activado.

Alternativamente, se puede purificar un producto de PEG activado para eliminar el material difuncional, sin embargo, dichas purificaciones son normalmente extremadamente laboriosas y consumen tiempo, así como difíciles de llevar a cabo. Por ejemplo, la cromatografía basada en gradiente, una solución para separaciones frecuentemente empleada, requiere el análisis de múltiples fracciones de eluato, utiliza un gran volumen de disolvente, y es poco adecuada para procedimientos a escala comercial. Más aún, las técnicas de separación basadas en gradiente raramente consiguen niveles de pureza aceptables, particularmente cuando se separan especies poliméricas de mayores pesos moleculares.

En suma, los procedimientos actuales para preparar PEG activados, particularmente PEG activados monofuncionales, son insatisfactorios en muchos aspectos. Para la mayor parte, los procedimientos actuales se basan en el uso de material de partida de mPEG relativamente caro, que a menudo contiene grandes cantidades del contaminante indeseable, PEG diol. Las soluciones sintéticas actuales para evitar la formación de diol son complicadas, requiriendo múltiples etapas adicionales de reacción, y pueden seguir dando como resultado la formación de cantidades detectables de PEG diol o subproductos derivados de PEG diol. Finalmente, las soluciones de separación existentes, en particular los procedimientos cromatográficos, son insatisfactorias por las razones descritas anteriormente.

Los solicitantes han detectado una necesidad continuada en la técnica de nuevos procedimientos para preparar PEG activados que (i) no se basen en caros materiales de partida poliméricos monofuncionales, (ii) no requieran múltiples etapas de reacción engorrosas adicionales, y (iii) superen los problemas asociados con la presencia de PEG diol proporcionando reactivos poliméricos de pureza elevada...

1. Un procedimiento para formar un polímero funcionalizado, que comprende

2. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que la etapa (b) se lleva a cabo en condiciones eficaces para formar no más del 25% del polímero disustituido.

3. Un procedimiento según la Reivindicación 1 en el que dicho polímero no peptídico y soluble en agua es lineal o ramificado.

4. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que dicho polímero no peptídico y soluble en agua se selecciona entre: poli(alquilenglicol), alcohol poli(olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacárido), poli(a-hidroxiácido), alcohol poli(vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), y los copolímeros, terpolímeros, y sus mezclas.

5. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que dicho polímero no peptídico y soluble en agua es un diol.

6. Un procedimiento según la Reivindicación 5, en el que dicho polímero no peptídico y soluble en agua es poli(etilenglicol).

7. Un procedimiento según la Reivindicación 5, en el que cada uno de los grupos hidroxilo se localiza en un extremo del polímero.

8. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que el polímero no peptídico y soluble en agua proporcionado en (a) está en un disolvente seleccionado entre: un disolvente orgánico, agua, una mezcla de agua y un disolvente miscible en agua, y una mezcla de agua y un disolvente orgánico inmiscible.

9. Un procedimiento según la Reivindicación 8, en el que dicho disolvente orgánico se selecciona entre:

10. Un procedimiento según la Reivindicación 8, en el que dicho disolvente orgánico se selecciona entre:

11. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que el peo molecular del polímero está entre 100 Da y 100.000 Da.

12. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que el peso molecular del polímero está entre 500 Da y 60.000 Da.

13. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que el peso molecular del polímero está entre 5.000 y 40.000 Da.

14. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha reacción se lleva a cabo en condiciones eficaces para formar no más de un 12 por ciento del polímero disustituido.

15. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que dicha reacción se lleva a cabo en condiciones eficaces para formar no más de un 8 por ciento del polímero disustituido.

16. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que dicha reacción se lleva a cabo en condiciones eficaces para formar no más de un 5 por ciento del polímero disustituido.

17. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que dicha reacción se lleva a cabo en condiciones eficaces para formar no más de un 2 por ciento del polímero disustituido.

18. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que dicha reacción se lleva a cabo en condiciones eficaces para formar no más de un 1 por ciento del polímero disustituido.

19. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que dicha reacción se lleva a cabo en condiciones eficaces para formar una relación de polímero monosustituido a polímero disustituido que es de 4:1 a 20:1.

20. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que dicha reacción se lleva a cabo en condiciones eficaces para formar una relación de polímero monosustituido a polímero disustituido que es de 10:1 a 18:1.

21. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que Y es un grupo funcional protegido, y la etapa (b) comprende adicionalmente, tras dicha etapa de reacción, desproteger dicho grupo funcional.

22. Un procedimiento según la Reivindicación 21, en el que Y es un ácido carboxílico protegido y dicha desprotección comprende hidrolizar dicho ácido carboxílico protegido para formar por tanto un ácido carboxílico.

23. Un procedimiento según la Reivindicación 22, en el que dicho ácido carboxílico protegido se selecciona entre: ésteres, tioésteres, amidas, amidatos, tioamidatos, e hidrazidas.

24. Un procedimiento según la Reivindicación 22, en el que dicho ácido carboxílico protegido es un ortoéster.

25. Un procedimiento según la Reivindicación 21, en el que Y es una amina protegida.

26. Un procedimiento según la Reivindicación 25, en el que Y es un carbonitrilo o amida primaria y dicha etapa de desprotección comprende reducir el carbonitrilo o la amida primaria para formar por tanto una amina.

27. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que dicha etapa de reacción comprende una reacción sustitución nucleófila o de adición nucleófila.

28. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que Y se selecciona entre: hidrato de aldehído, hidrato de cetona, amina, hidrazida, tiol, ácido carboxílico, amida primaria, amida secundaria, amidato, 1,3-oxazolina 2-sustituida, 1,3-(4H)-dihidrooxazinas 2-sustituidas, 1,3-tiazolina 2-sustituida, 1,3-(4H)-dihidrotiazinas 2 sustituidas, ditiopiridina, vinilpiridina, hidroxilamina, y oxima.

29. Un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que uno del uno o más reactivos de funcionalización tiene la estructura X-(CR₁R₂)_m-Y, en la que:

30. Un procedimiento según la Reivindicación 16, en el que uno del uno o más reactivos de funcionalización tiene la estructura X-(CR₁R₂)_m-Y, en la que:

31. Un procedimiento según la Reivindicación 29, en el que X se selecciona entre: un grupo saliente, un grupo vinilo sustituido, y un grupo vinilo no sustituido.

32. Un procedimiento según la Reivindicación 31, en el que X es un halógeno o un éster de sulfonato.

33. Un procedimiento según la Reivindicación 1, que comprende la etapa de alquilar el polímero no peptídico que comprende dos grupos hidroxilo antes de la etapa (b), o alquilar la mezcla formada en la etapa (b) antes de o posteriormente a la etapa de purificación (c).

34. Un procedimiento según la Reivindicación 33, en el que dicha etapa de alquilación comprende tratar la mezcla con un agente alquilante seleccionado entre: dialquilsulfato, alquil sulfonato, diazoalcano, haluro de alquilo, N,N'-dimetilformamida dialquil acetal, 3-alquil-1-p-toliltriazeno, hidróxido de trimetilanilinio, fluoroborato de trialquiloxonio, hexafluorofosfonato de trimetilsulfonio, y tricloroacetimidato de alquilo.

35. Un procedimiento según la Reivindicación 33, en el que dicha alquilación es eficaz para convertir grupos hidroxilo en dicha mezcla en -OR', en el que R' es un radical orgánico que tiene 1-20 átomos de carbono.

36. Un procedimiento según la Reivindicación 35, en el que R' se selecciona entre: metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, y bencilo.

37. Un procedimiento según la Reivindicación 1, que comprende adicionalmente antes de la etapa (b), convertir una porción de dichos hidroxilos poliméricos en un grupo saliente, Y, para formar por tanto una primera mezcla que comprende el polímero no peptídico y soluble en agua procedente de la etapa (a), un polímero monosustituido que comprende un único grupo Y, y un polímero disustituido que comprende dos grupos Y, en condiciones eficaces para formar no más de un 45 por ciento del polímero disustituido.

38. un procedimiento según la Reivindicación 1, en el que Y es un grupo funcional ionizable y dicha etapa de purificación comprende purificar la mezcla mediante cromatografía de intercambio iónico.

39. Un procedimiento según la Reivindicación 38, en el que dicha etapa de purificación comprende:

40. Un procedimiento según la Reivindicación 39, en el que dichas condiciones en dicha etapa de elución comprenden una columna suficientemente dimensionada para adsorber sustancialmente todo de dicho polímero disustituido.

41. Un procedimiento según la Reivindicación 39, en el que dichas condiciones en dicha etapa de purificación comprenden una o más columnas principales suficientemente dimensionadas para adsorber sustancialmente todo de dicho polímero monosustituido.

42. Un procedimiento según la Reivindicación 39, en el que:

43. Un procedimiento según la Reivindicación 38, en el que dicha etapa de purificación comprende:

44. Un procedimiento según la Reivindicación 1 que comprende:

45. Un procedimiento según la Reivindicación 44, en el que la etapa (c) se lleva a cabo en condiciones eficaces para formar no más de un 25% de Y-L_0.1-POLI-L_0.1-Y.

46. Un procedimiento según la Reivindicación 44, en el que X es un halógeno o un éster de sulfonato.

47. Un procedimiento según la Reivindicación 44, en el que dicha etapa de purificación comprende:

48. Un procedimiento según la Reivindicación 47, en el que el ligante opcional, L_0.1, está presente y es estable frente a la hidrólisis.

49. un procedimiento según la Reivindicación 47, en el que el ligante opcional, L_0.1, está presente y tiene una estructura -(CR₁R₂)_m-, en la que R₁ y R₂ son cada uno independientemente H o alquilo, y m varía entre 0-10.

50. Un procedimiento según la Reivindicación 47, en el que Y es una amina o un ácido carboxílico.

51. Un procedimiento según la Reivindicación 47, en el que dicha etapa de alquilación comprende tratar la mezcla con un agente alquilante seleccionado entre: dialquilsulfato, alquil sulfonato, diazoalcano, haluro de alquilo, N,N'-dimetilformamida dialquil acetal, 3-alquil-1-p-tolitriazeno, hidróxido de trimetilanilinio, fluoroborato de trialquiloxonio, hexafluorofosfonato de trimetilsulfonio, y tricloroacetimidato de alquilo.

52. Un procedimiento según la Reivindicación 47, en el que dicha etapa de alquilación es eficaz para convertir los grupos hidroxilo en dicha mezcla en -OR', en el que R' se selecciona entre: alquilo C₁-C₂₀, alquilo C₁-C₂₀ sustituido, alquileno C₁-C₂₀-arilo, y alquileno C₁-C₂₀-arilo sustituido.

53. Un procedimiento según la Reivindicación 52, en el que R' se selecciona entre: metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, y bencilo.

54. Un procedimiento según la Reivindicación 47, en el que X es un nucleófilo efectivo para desplazar -Z.

55. Un procedimiento según la Reivindicación 54, en el que Z es un grupo saliente seleccionado entre: halógeno y ésteres de sulfonato.

56. Un procedimiento según la Reivindicación 49, en el que

57. Un procedimiento según la Reivindicación 56, en el que el grupo de ácido carboxílico protegido se selecciona entre: nitrilo, amida, éster de alquilo, y ortoéster.

58. Un procedimiento según la Reivindicación 47, en el que:

59. Un procedimiento según la Reivindicación 47, en el que:

60. Un procedimiento según la Reivindicación 49, en el que el reactivo de funcionalización se selecciona entre:

en el que:

61. Un procedimiento según la Reivindicación 44, en el que dicha conversión comprende hacer reaccionar HO-POLI-OH con X'-SO₂-R₃, en el que R₃ es alquilo, alquilo sustituido, arilo, o arilo sustituido, y X' es Br o Cl.

62. Un procedimiento según la Reivindicación 61, en el que R₃ es p-tolilo, metilo, trifluorometilo, o trifluoroetilo.

63. Un procedimiento según la Reivindicación 44, que comprende adicionalmente, tras dicha etapa de purificación, transformar Y del polímero sustancialmente puro en un resto reactivo diferente.

64. Un procedimiento según la Reivindicación 44, en el que dicho resto reactivo comprende un grupo funcional seleccionado entre: hidroxilo, éster activo, carbonato activo, ortoéster, acetal, aldehído, hidrato de aldehído, cetona, hidrato de cetona, oxima, alquenilo, acrilato, metacrilato, nitrilo, amida primaria o secundaria, imida, acrilamida, sulfona activa, amina, hidrazida, tiol, ácido carboxílico, isocianato, isotiocianato, maleimida, succinimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, amidato, 1,3-oxazolina 2-sustituida, 1,3-(4H)-dihidrooxazinas 2 sustituidas, 1,3-tiazolina 2-sustituida, 1,3-(4H)-dihidrotiazinas 2 sustituidas, hidroxilamina, yodoacetamida, disulfuro de ortopiridilo, epóxido, glioxal, diona, mesilato, tosilato, y tresilato.

65. Un procedimiento según la Reivindicación 44, en el que Y es un grupo funcional protegido y dicho procedimiento comprende adicionalmente desproteger el grupo funcional antes de dicha purificación.

66. Un procedimiento según la Reivindicación 60, en el que la mezcla en la etapa (a) comprende CH₃O-POLI-OCH₃, en combinación con H₃CO-POLI-L_0.1-Y e Y-L_0.1-POLI-L_0.1Y, en el que L es un ligante opcional e Y es un grupos funcional.

67. Un procedimiento según la Reivindicación 66, en el que la mezcla comprende no más de un 40% en peso de HO-POLI-OH e Y-L_0.1-POLI-L_0.1-Y en combinación.

68. Un procedimiento según la Reivindicación 67, en el que la mezcla comprende no más de un 10% en peso de HO-POLI-OH e Y-L_0.1-POLI-L_0.1-Y en combinación.